土壤的有机物污染已对土地资源可持续利用与农产品生态安全构成威胁,生物修复(bioremediation)是近几十年发展起来的治理土壤污染的新技术,它与传统的土壤修复技术相比,具有高效、处理彻底、费用低廉以及无二次污染的优点,其中,生物增强(bioaugrnentation)被应用地越来越广泛。与此同时,分子生物学技术的高速发展,使得研究生物修复对土壤中不可培养的微生物群落,尤其是土壤中对全球物质循环起着重要作用的功能菌群群落的影响成为可能,并且迅速成为了一个热点。以前在植物生态学中应用较多的多元变量分析也逐渐地进入了微生物生态学的研究领域,利用这种分析我们可以更加清楚微生物群落结构、功能以及环境因素之间的相互关系。　　 本研究主要包含三个部分的实验内容,前两个实验与硝基酚污染土壤的生物修复以及对土壤主要的土著菌群、与氮循环相关的功能菌群的群落结构影响有关,第三个实验与一种假单胞菌中环己胺的代谢途径研究相关。　　 硝基酚包括三种同分异构体,对硝基酚(P-nitrophenol,PNP)、间硝基酚(m-nitrophenol,MNP)以及邻硝基酚(o-hitrophenol,ONP),它们易溶于水,对动植物以及人类有潜在的致畸致癌作用。第一个实验将PNP降解菌Pseudomonas sp.Strain WBC-3、MNP降解菌Cupriavidus necator JMP134以及ONP降解菌Alcaligenes sp.strain NyZ215接入到三种硝基酚污染的土壤中进行生物增强。实验设计了5个土壤处理组,分别为自然土(T1)、自然土加三种硝基酚(T2)、自然土加三种硝基酚加三种接入菌(T3)、灭菌土加三种硝基酚(T4)以及灭菌土加三种硝基酚加三种接入菌(T5),每个处理组设了三组重复,30℃培养。相对于污染处理(T2和T4),生物增强的处理(T3和T5)中三种硝基酚降解都要快得多,释放的铵根和亚硝酸根在生物增强的处理中积累的也快一些,这些现象表明了接入菌确实在生物增强过程中发挥了作用。Real-time PCR结果表明三种细菌在实验过程以及底物降完之后尽管和初始含量相比下降了2个数量级左右,但都能在系统中稳定的存在。对不同样品不同时间点的DGGE图谱进行Pareto-Lorenz曲线分析,表明生物增强处理对土著菌群的结构影响不是很显著。除此之外,硝基酚在自然土污染处理(T2)比在灭菌土污染处理(T4)中降低得快得多,显示了利用自然土著菌群进行生物修复的巨大潜力。　　 第二是实验内容是以对硝基酚污染土壤的生物修复为基础,研究对硝基酚污染以及生物修复对于水稻土壤中氨氧化菌群,即氨氧化细菌(ammonia-oxidizingbacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidifing archaea,AOA)的群落结构的影响。相对于PNP的污染处理,生物增强处理中PNP的快速下降表明了PNP降解菌Pseudomonas sp.strain WBC-3发挥了它降解底物的作用。Real-time PCR数据表明WBC-3能在土壤中稳定的存在。此外,还通过real-time PCR对AOB和AOA的amoA基因数量进行定量,数据表明最初的AOB含量高于AOA,这与以前的报道在中性偏碱性土壤中AOB占优,发挥更大作用相一致。对污染处理和生物增强处理分别于不同时间点取样以AOB和AOA的amoA基因为靶标,进行DGGE分析,然后通过对DGGE图谱的数据进行冗余分析RDA(redundancyanalysis)来揭示PNP污染和生物修复对氨氧化菌群的群落结构的变化影响。　　 最终,所有的数据分析表明,PNP污染对土壤中AOB和AOA的种群数量以及群落结构都没有显著的影响,但是双变量有重复的方差分析表明生物增强过程显著抑制了AOB和AOA的种群数量,这可能是由于铵根离子浓度的升高导致的,有文献报道铵根离子浓度的提高会抑制硝化作用。另外,RDA分析表明,时间和生物增强处理两种因素的影响共同导致了AOA群落结构的影响,单独一个因素的影响都没有统计学意义,而生物修复处理单个因素显著影响了AOB的群落结构,具有统计学意义。综上所述,在我们所选择的水稻土样品中,AOB在氨氧化过程中所起的作用大于AOA,在受到生物增强处理的过程中,AOB受到的影响比AOA大。本研究的创新点在于还没有有关污染物的生物修复过程对AOB和AOA的群落结构影响的研究报道。　　 我们还将AOB和AOA的一些主要物种条带回收测序,进化分析表明,所有的AOB物种都属于Nitrosospira属,主要集中在cluster4、cluster9、cluster3a、cluster3c中。而AOA的物种都集中在cluster S中,所获得的条带序列相似性与有水覆盖有关的环境样品中所获得的条带序列相似性最高。　　 Pseudomonas plecoglossicida NyZ12是我们实验室筛选得到的一株能利用环己胺为唯一碳源、氮源和能源生长的菌株,目前还没有对于环己胺代谢的分子生物学水平的报道。我们通过简并PCR的方法扩增得到环己胺代谢过程中的一个酶环己酮单加氧酶(cyclohexanone monooxygenase,ChnB)的基因片段,大约400bp,然后以它为起始点,朝两端genome walking,大约几轮之后,得到14kb的片段,在NCBI数据库中进行比对,发现除了环己胺氧化酶(环己胺代谢的第一个酶)之外的剩余的几个酶基因片段。我们通过同源重组的方法在NyZ12体内成功敲除了chnB基因,此时NyZ12不能利用环己胺或者环己酮生长,证明了NyZ12确实是通过环己酮途径代谢环己胺的。遗憾的是,我们尝试了几种不同方法,转座突变,简并PCR,野生菌纯化等都未得到环己胺氧化酶的基因序列。