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胶质瘤是颅内最常见恶性肿瘤之一，预后不良。即使是近年来神经科学的发展，胶质瘤尤其是多形性胶质母细胞瘤目前的所有治疗方法均无有效治愈方法。TRAIL(可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)与存在于细胞膜上的DR受体特异性结合能够启动肿瘤细胞的程序性死亡，而对正常细胞相对无此作用。但研究发现，TRAIL对肝细胞有一定的毒性作用，sTRAIL没有与此相关的副作用，这为我们治疗胶质瘤提供了一个新的途径。我们完整克隆人脾sTRAIL基因，成功构建sTRAIL真核表达载体，利用Lipofectin转染C6胶质瘤细胞进行体外实验：胶质瘤裸鼠动物模型建立进行体内实验，获得了初步的结果，为寻求胶质瘤治疗的新方法，进而攻克这一颅内恶性肿瘤的难题提供了理论依据。材料与方法1、主要试剂：E．coli TG1菌种、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DMSO、胰蛋白酶、Trizol、限制性内切酶、PCR试剂盒、PUCm一T载体、PcDNA3.1、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒；DMEM、Lipofectin、G418等；引物合成和测序服务由上海生工提供。2、引物设计根据GenBank数据，用引物设计软件DNAstar设计sTRAIL基因引物如下：上游：5-GCGAATTCAGTATGGTGAGAGAAAGAGGTC-3；下游：5-ACAGTAGGATCCTCCAGGTCAGTTAGCCA-3。3、总RNA提取与目的基因的克隆无菌条件下取小块人脾脏组织，碾磨匀浆，Trizol一步法提取总RNA。严格按照Access RT-PCR System说明书，以人脾脏总RNA为模板，由下游引物引导，进行RT反应。以RT产物为模板，由上述上、下游引物引导，进行PCR扩增。PCR产物电泳，将540bp附近出现的特异性条带切胶回收、提纯即得到目的基因。将目的基因连接PUCm一T载体并转化感受态大肠杆菌进行扩增，获得纯化质粒并初步酶切鉴定后送上海生工公司进行序列测定。4、构建真核表达载体T-sTRAIL经测序鉴定证实克隆成功，EcoR-I和BamH-I双酶切，切胶回收541bp的sTRAIL片段。与EcoR-I和BamH-I双酶切的真核表达载体PcDNA3.1连接。所得重组质粒命名为PcDNA-sTRAIL。5、PcDNA-sTRAIL对胶质瘤增殖的影响：利用MTT等技术，体外检测PcDNA-sTRAIL转染后的胶质瘤细胞的抑制作用；建立裸鼠胶质瘤模型，体内实验观察PcDNA-sTRAIL对胶质瘤的治疗作用。结果1、无菌条件下提取小块人脾脏组织总RNA，经凝胶电泳，EB染色，紫外线灯下28S和18S条带清晰可见，提示RNA未降解。2、RT-PCR结果PCR产物经凝胶电泳与分子质量标记比较显示约可见540bp处有一特异性条带，与预期sTRAIL基因分子量吻合，切胶回收。3、酶切鉴定与序列测定：T-sTRAIL经EcoR-I和Bamh-I双酶切，电泳可见两条特异性条带，大小分别为Ikb和540bp左右，与预期(大小分别为Ikb和541bp)符合，初步判定，所得产物即为目的基因。送上海生工公司进行序列测定，测序结果通过NCBI网站BLAST等对比，提示T-sTRAIL的插入片段的序列与GenBank数据库序列完全一致，证实为人类sTRAIL基因DNA。4、重组质粒PcDNA-sTRAIL鉴定PcDNA-sTRAIL经EcoR-I和Bamh-I双酶切，电泳可见两条特异性条带，大小分别为5.9kb和540bp左右，与预期(大小分别为5.9kb和541bp)符合，表明重组真核载体成功构建。5、PcDNA-sTRAIL对C6胶质瘤细胞的抑制作用：治疗观察显示，与PBS和空质粒组相比，治疗组均明显抑制肿瘤生长，差别有显著性意义(p均＜0.01)；PcDNA-sTRAIL治疗组抑制肿瘤生长明显。6、C6胶质瘤裸鼠模型构建成功，成瘤率为100％。7、PcDNA-sTRAIL对C6胶质瘤裸鼠的治疗作用：治疗组能使荷瘤裸鼠平均瘤重和平均体积均显著低于对照组。组织学检查发现，经PcDNA-sTRAIL治疗的裸鼠，肿瘤组织局部坏死明显，在瘤体周围和瘤体内有大量炎症细胞浸润，显著好于对照组(p均＜0.01)。结论1、正确构建了T-sTRAIL克隆载体，测序结果与GenBank数据库序列完全一致。2、正确构建了人类PcDNA-sTRAIL真核表达载体，双酶切结果提示与预期一致。3、构建的PcDNA-sTRAIL表达载体具有高效、稳定的表达sTRAIL的能力，为进一步的研究奠定了基础。4、成功建立了C6荷瘤裸鼠动物模型。5、PcDNA-sTRAIL治疗胶质瘤可使荷瘤裸鼠平均瘤重和平均体积降低，肿瘤组织局部坏死明显，炎症细胞大量浸润，显示了在胶质瘤治疗中良好的前景。