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Villin/gelsolin/fragmin超家族蛋白是目前已知的唯一一类Ca<2+>依赖性肌动蛋白结合蛋白,其在植物细胞微丝骨架调控的过程中起着十分重要的作用。利用生物信息学对拟南芥(Arbidopsis)和水稻(Oryza sativa L.)的基因组数据库进行的分析表明,其中不存在单独编码 gelsolin/fragmin 成员的基因,而在动物细胞中,该家族成员由各自独立的基因编码。因此,人们普遍认为在植物中编码gelsolin/fragmin成员的mRNA可能是由villin的mRNA经选择性剪接后形成的,但迄今为止还没有直接的证据证明此观点。本文克隆了一个编码分子量约29 kDa的Villin/gelsolin/fragmin超家族新成员的全长cDNA并对其基因来源进行了初步验证,同时通过体内外的一系列实验对此新成员的功能进行了研究。
利用巢式PCR的方法,我们从麝香百合(Lilium longiflorum L.)花粉cDNA表达文库和麝香百合花粉RNA中都成功克隆到了一个1006bp的全长cDNA序列,除了终止密码子前16bp和整个的3’UTR外,此序列与135-ABP(麝香百合的villin)的cDNA序列完全一致。该全长cDNA序列编码一个由263个氨基酸组成的分子量为29 kDa的蛋白(L1ABP29),其仅仅包括G1和G2结构域,是目前所有已鉴定的villin/gelsolin/fragmin超家族中最小的成员。同时我们克隆了编码L1ABP29的部分基因组序列,并将此序列与L1ABP29和135-ABP的cDNA序列进行了比对分析。分析结果表明,LIABP29 cDNA的整个特异序列有可能是编码135-ABP基因的一个内含子。由于L1ABP29的特异序列是从5’GT开始的而GT 是绝大多数内含子保守的剪切供体,并且植物基因组中没有编码gdsolin/fragmin的基因,由此我们推断L1ABP29是植物villin-135-ABP的一个mRNA选择性剪接产物。此外,利用DNase I亲和层析的方法,我们从百合花粉中分离得到了L1ABP29,进一步通过western免疫印迹发现,L1ABP29在花粉萌发的不同时期都有恒定的表达。
利用原核表达的方法,我们在大肠杆菌(E.coli)中表达并纯化了纯度大于90%的GST-L1ABP29重组融合蛋白,并用此重组蛋白研究了L1ABP29的生化功能。虽然缺失了其它villin/gelsolin/fragmin超家族成员都含有的G3区,纯化的L1ABP29在体外仍然具有Ca<2+>和PIP<,2>依赖性的促进肌动蛋白成核、抑制微丝正端聚合、抑制微丝解聚以及结合并剪切微丝的功能;利用显微注射技术向紫露草雄蕊毛细胞中引入L1ABP29能破坏细胞中的微丝结构、从而导致其细胞核发生位移;在稳定表达L1AABP29-RFP的烟草BY-2悬浮细胞中,L1ABP29可与其中的微丝共定位并导致细胞中微丝的片段化;利用基因枪的方法在百合花粉中瞬时表达L1ABP29则导致了花粉粒、花粉管顶端至主干区中部的微丝骨架的片段化,并且抑制了花粉萌发和花粉管生长。本文首次报道了一个编码植物gelsolin/fragmin成员的全长cDNA,并且证明L1ABP29是百合villin的一个mRNA选择性剪接产物,同时在花粉总蛋白中也发现了其相对应的蛋白产物。此外,体内外的一系列实验也表明,L1ABP29作为villin/gelsolin/fragmin 超家族的一个新成员,可能是许多信号途径(例如:Ca<2+>、PIP<,2>)的下游底物并通过感应这些细胞分子调控微丝骨架的动态变化,从而在调控花粉萌发和花粉管生长过程中发挥重要作用。