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新城疫(Newcastle Disease,ND)又名亚洲鸡瘟,是由副黏病毒属新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种多病型的高度接触性传染病,主要侵害鸡、火鸡、其它家禽和野禽类,也可感染人,是一种世界范围内禽类的重要的通报疫病,也是我国养禽业几十年来长期坚持免疫预防的主要传染病之一。新城疫的流行,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。目前,对于ND的诊断方法主要有病毒分离、血凝和血凝抑制试验、ELISA、RT-PCR等,但由于这些方法耗时冗长或需要特殊的仪器设备及技术人员,难以满足简便、实时快速诊断的要求。胶体金免疫层析方法是以条状纤维层析材料为固相载体,通过毛细管作用,以胶体金为示踪物来显示结果的一种新型的检测方法,具有操作简单、快捷,分析结果清楚、易于判断,且不需要任何仪器、成本低廉等优点,非常适用于现场检测及自动化检测分析。因此,该方法已在医学快速检测领域得到了迅猛发展,近年来已逐渐应用于动物医学领域的快速检测。本研究利用原核表达的HN重组蛋白,采用间接法胶体金免疫层析法的原理,在国内率先建立了鸡新城疫抗体免疫胶体金速测技术,取得了如下研究结果:1.新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(aN)基因的亚克隆、表达及蛋白纯化设计一对分别带有BamHⅠ或XhoⅠ酶切位点的引物,利用PCR以及亚克隆的方法,从本室保存的表达质粒pGEX-KG-HN克隆出一段新城疫病毒La Sota系缺失胞质区、跨膜区的HN基因,将扩增产物克隆进pMD18-T载体,经限制性酶切鉴定,得到大小约1600bp的基因。再将其克隆到pGEX-6p-1中,与GST蛋白融合表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,共表达两种融合蛋白,分子量分别为88KD和58KD,Western blot印迹表明两种表达蛋白均具有较好的免疫反应活性。生物信息软件分析,HN-GST融合蛋白是疏水性蛋白,理论pI值为9.9。表达蛋白经亲和层析方法纯化得到纯度较高的HN-GST融合蛋白。2.鸡新城疫抗体免疫胶体金速测试纸条的研制及其初步应用采用柠檬酸三钠还原法,确立了20nm胶体金的制备条件;并利用制备好的胶体金,优化了鼠抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的标记条件:单抗的最佳标记pH为8.0,最适标记量为12μg/mL。以纯化的HN-GST融合蛋白和兔抗鼠IgG分别作为检测线和质控线捕获试剂,以金标抗鸡IgG Fc段单克隆抗体为探针,初步建立了检测鸡新城疫病毒血清抗体的速测胶体金速测试纸条。重组HN-GST融合蛋白的最佳喷膜浓度为400μg/mL,兔抗鼠IgG的最佳喷膜浓度为1mg/mL,该试纸条与禽流感H5亚型、禽流感H9亚型、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊、鸡毒霉形体、滑液霉形体等阳性血清均无交叉反应,灵敏度比HI方法低一个滴度,该方法重复性好,与HI方法符合率为96.9%,结果可在10～15min内判定。用该试纸条检测了湖北、河南等地的150份被检鸡血清,总阳性率为84.7%。试验表明:该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、快速等优点,可用于鸡新城疫血清抗体水平的快速监测。