论文部分内容阅读
目的:从NLRP3炎症小体途径探讨竹节参总皂苷（saponins of panax japonicus,SPJ）对高脂饮食小鼠认知功能衰退的改善作用。方法:将Balb/c小鼠随机分为正常对照组（normal controal,NC）,高脂饮食组（high fat diet,HFD）,高脂饮食+SPJ低剂量组(15 mg·kg-1),高脂饮食+SPJ高剂量组(45mg·kg-1),每组12只,除NC组给予正常饲料外,其余各组均给予60%高脂饲料。药物组每天灌胃给予相应剂量的SPJ,NC组和HFD组同时灌胃等量的生理盐水。喂养期间定期检测记录各组小鼠体重和血糖水平变化,持续喂养16周后采用Morris水迷宫观察各组小鼠学习记忆能力的变化;随后处死小鼠快速取出脑组织。主要检测指标如下:（1）HE染色观察各组小鼠脑组织皮层和海马（CA1、CA3、DG区）部位组织形态及神经元细胞病理变化;（2）Western blot法检测各组小鼠脑皮层和海马组织中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）、环氧酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）、白细胞介素1β（interleukin-1beta,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）等炎症相关因子以及NLR家族含PYD结构域蛋白3（NLR family PYD domain containing protein 3,NLRP3）炎症小体相关蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1（Cysteine-containing aspartate-specidic proteases,Caspase-1）等的蛋白表达变化;（3）Western blot法检测各组小鼠脑皮层和海马组织中认知功能相关的N-甲基-D-天冬氨酸（N-methy-D-aspartate,NMDA）受体NMDAR2A和NMDAR2B以及α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazole proprionic acid receptor,AMPA）受体Glu A1和Glu A2的总蛋白和膜蛋白表达水平变化;并检测钙调蛋白激酶2（Calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,Ca MKⅡ）和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（c AMP response element binding protein,CREB）的磷酸化蛋白表达水平。（4）免疫荧光法检测NLRP3炎症小体以及NMDA受体（NMDAR2A、NMDAR2B）和AMPA受体（Glu A1、Glu A2）与神经元和小胶质细胞的共定位表达情况。结果:（1）各组小鼠体重随时间的增长而增加,与NC组相比,HFD组小鼠体重显著增加,SPJ药物剂量组可显著降低小鼠体重（P<0.05或P<0.01）。（2）葡萄糖耐量试验结果显示,HFD组小鼠空腹血糖值明显高于NC组;灌胃给予葡萄糖0.5 h后,各组小鼠血糖值均达到高峰,并随时间而逐渐下降。NC组小鼠在各时间段血糖值均显著低于高脂饮食组（P<0.01）,HFD组表现为糖耐量减退,而SPJ用药后可显著改善这一情况（P<0.05或P<0.01）。（3）Morris水迷宫实验结果发现HFD组小鼠学习记忆能力较NC组显著降低（P<0.05或P<0.01）,而SPJ干预后,HFD组小鼠学习记忆能力显著改善（P<0.05或P<0.01）。（4）HE染色结果显示,HFD组小鼠脑组织皮层和海马部位神经细胞排列散乱,出现大量变性,细胞核固缩为不规则形状,而SPJ用药后,可显著改善高脂饮食小鼠这一病理变化。（5）Western blot结果显示,与NC组比较,HFD组小鼠皮层和海马组织中炎症相关因子i NOS、COX-2、IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平显著升高,NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达水平显著升高（P<0.05或P<0.01）。SPJ干预后,可显著降低NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、i NOS、COX-2、和TNF-α的蛋白表达水平（P<0.05或P<0.01）。（6）Western blot结果显示,与NC组比较,HFD组皮层和海马中认知功能相关蛋白NMDA受体亚型NMDAR2A、NMDAR2B和AMPA受体亚型Glu A1、Glu A2的总蛋白和膜蛋白表达量均显著降低,Ca MKⅡ和CREB的磷酸化蛋白水平显著下调（P<0.05或P<0.01）;而SPJ干预后,可显著上调NMDAR2A、NMDAR2B、Glu A1、Glu A2的总蛋白和膜蛋白水平,显著上调p-Ca MKⅡ、p-CREB的蛋白表达水平（P<0.05或P<0.01）。（7）免疫荧光结果显示:NLRP3炎症小体以及NMDA受体（NMDAR2A、NMDAR2B）和AMPA受体（Glu A1、Glu A2）在小胶质细胞和神经元上均有表达。结论:竹节参总皂苷能够明显改善高脂饮食所致小鼠认知功能障碍,其机制可能与抑制NLRP3炎症小体的激活和IL-1β的分泌进一步上调NMDA受体和AMPA受体信号通路相关蛋白的表达有关。