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背景和目的:脓毒症(sepsis)是由感染引起的失调性宿主反应,其病理机制复杂,较普遍的观点认为是机体对病原体失调的炎症反应,在抵抗病原微生物的同时损害了自身器官组织,严重时可导致心、肾、肺等多器官功能障碍(MODS),研究显示,脓毒症患者中近40%-50%发生心肌抑制,7%发生心力衰竭[1]。故炎症反应是脓毒症的病理生理基础,控制炎症反应是防治MODS的重要环节。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是机体内重要的脂质信号分子,与细胞表面5种G蛋白偶联型受体(S1P1-S1P5)相结合,通过受体介导的信号通路发挥不同作用。既往研究表明,S1P与炎症关系密切,FTY720作为S1P的结构类似物,已被用于多发性硬化治疗,且研究表明,FTY720与脓毒症、炎症性肠病、肿瘤、心肌梗塞等多种疾病的病理生理过程相关。但其在脓毒症所致的心功能障碍中的作用研究较少,因此,本研究通过细胞实验,应用细菌脂多糖(LPS)刺激大鼠心肌细胞,予以不同浓度的FTY720进行干预,检测相关炎性细胞因子以及蛋白表达的变化情况,阐明S1P通过对心肌细胞自分泌的影响,对脓毒症心肌细胞起到保护性作用。实验方法:1、大鼠心肌细胞株H9C2的培养:DMEM高糖培养基+10%胎牛血清,37℃、5%C02细胞培养箱中培养。2、LPS对心肌细胞炎性细胞因子分泌的影响:用不同浓度(0、1、2、5、10 μ g/ml)的LPS分别攻击心肌细胞8h、12h、24h、36h、48h,收集细胞上清,用于测定细胞上清中细胞因子TNF-α、IL-1 β的水平。3、心肌细胞炎症反应通路及凋亡蛋白的测定:采用同一浓度(5 μg/ml)的LPS刺激心肌细胞Oh、8h、12h、24h、36h、48h,提取细胞蛋白,采用Western blot技术检测心肌细胞P-I κ B α、procaspase-3、ERK1/2蛋白的表达水平。4、不同浓度的FTY720干预后细胞因子分泌的变化:将心肌细胞分为以下六组,空白对照组、LPS(5μg/ml)组、FTY720(10nM)+LPS(5μg/ml)组、FTY720(50nM)+LPS(5 μ g/ml)组、FTY720(100nM)+LPS(5μg/ml)组、FTY720(200nM)+LPS(5μg/ml)组,干预的总时间均为24h,收集细胞上清,采用ELISA法测定上清中TNF-α、IL-1 β的浓度。5、FTY720干预后对炎症反应通路及凋亡蛋白的影响:提取细胞蛋白,使用Western Blot方法检测各组细胞P-I κ B α、procaspase-3、ERK1/2蛋白的表达变化。6、选择性S1P1/3受体的抑制剂VPC23019和ERK激酶的抑制剂PD98059对ERK1/2蛋白表达的影响:将心肌细胞分为以下六组,L组(予5 u g/ml的LPS刺激)、L+F 组(予 5 μ g/ml 的 LPS 及 100 nM 的 FTY720 刺激)、L+F+V 组(予5 μ g/ml 的 LPS、100nM 的 FTY720 及 VPC23019 刺激)、L+V 组(予 5 μg/ml的 LPS 及 VPC23019 刺激)、L+F+P 组(予 5 μ g/ml 的 LPS、100 nM 的 FTY720及 PD98059 刺激)、L+P 组(予 5 μ g/ml 的 LPS 及 PD98059 刺激),采用 Westem Blot方法检测心肌细胞ERK1/2蛋白的表达水平。7、FTY720、VPC23019及PD98059对细胞增殖活力的影响:将细胞分为con组、L组、L+F组、L+F+V组、L+F+P组,MTT试验检测各组细胞的增殖活力。结果:1、LPS对心肌细胞炎性细胞因子分泌的影响:LPS能够刺激心肌细胞分泌炎性细胞因子TNF-α和IL-1 β,分泌量与LPS呈浓度依赖性,LPS在浓度为5μ g/ml和10μg/ml时能刺激TNF-α和IL-1 β显著分泌,与空白对照组相比具有统计学差异(P<0.05),并于刺激后24h达到高峰。2、心肌细胞炎症反应通路及凋亡蛋白的测定:Western Blot结果显示,LPS(5 μ g/ml)刺激心肌细胞,可使胞浆中P-I κ B α表达水平增高,于24小时达到高峰,与空白对照组相比具有统计学差异(P<0.05);procaspase-3表达水平于12小时达到高峰,而ERK1/2蛋白表达于12小时达到最低。3、FTY720干预后细胞因子分泌的变化:FTY720可减少炎性细胞因子TNF-α 的分泌,空白对照组、LPS 组、LPS+FTY720(10nM)组、LPS+FTY720(50nM)组、LPS+FTY720(l00nM)组、LPS+FTY720(200nM)组细胞上清 TNF-α的水平分别为:19.6±2.0pg/ml、40.8±2.5pg/ml、39.9±2.2pg/ml、29.8±2.4pg/ml、27.4±2.4pg/ml 和 28.1±1.0pg/ml,其中 FTY720 的干预浓度在 50nM、100nM 及200nM时,TNF-α的分泌量与LPS相比,具有统计学差异;而IL-1 β在各组中的水平分别为:19.1±2.2pg/ml、46.8±3.5pg/ml、44.5±2.1pg/ml、37.5±3.6pg/ml、39.2±2.8pg/ml和43.5±4.5pg/ml,FTY720不能减少脓毒症心肌细胞IL-1 β的分泌。4、FTY720干预后对炎症反应通路及凋亡蛋白的影响:FTY720干预后,可降低P-IκBα、procaspase-3的表达,并使ERK1/2表达水平增高。5、选择性S1P1/3受体的抑制剂VPC23019和ERK激酶的抑制剂PD98059对ERK1/2蛋白表达的影响:VPC23019及PD98059均可使ERK1/2表达减少,FTY720 通过 S1P1/3 激活 MAPK-ERK1/2 通路。6、FTY720、VPC23019及PD98059对细胞增殖活力的影响:L组与con组相比,细胞增殖活力受到明显抑制,FTY720干预后细胞的增殖活力明显增强;而L+F+V组及L+F+P组细胞的增殖亦受到明显抑制,与L+F组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1、LPS刺激可引起体外培养大鼠心肌细胞炎性细胞因子TNF-α及IL-1β的释放增加,NF-κ B信号通路被激活;procaspase-3表达增加的同时,ERK1/2蛋白的表达减少,心肌细胞凋亡增加。2、FTY720可通过影响心肌细胞的自分泌,减少炎性细胞因子TNF-α的分泌,抑制Iκ B α磷酸化,降低procaspase-3表达的同时,增加了 ERK1/2的表达,且是通过S1P1/3激活ERK1/2通路,起保护性作用的受体为S1P1、S1P3受体,进而对脓毒症的心肌细胞起到抗炎、抗凋亡、促存活的保护性作用。