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T细胞作为人体获得性免疫的重要组成部分,在机体抵抗外来病原体的入侵、肿瘤细胞的免疫监督以及维持机体的免疫稳态中发挥重要的作用。一般认为,成熟的血细胞主要由骨髓中的造血干细胞逐步分化而来,然而,T细胞的发育过程需要在胸腺特殊的微环境中完成。研究表明,T细胞发育起始于骨髓或胎肝的胸腺定植祖细胞（thymus seeding progenitor,TSP）,它们在趋化因子的招募作用下迁移、定植到胸腺并发育成为早期胸腺祖细胞（early thymic progenitor,ETP）,随后在胸腺微环境的支持下经历CD4-CD8-双阴性、CD4+CD8+双阳性以及CD4+或CD8+单阳性三个主要的T细胞发育阶段,特化为成熟的功能性T细胞[1,2]。由于TSP和ETP数量极为稀少[3],常规的方法难以对其进行有效地捕获。目前对于人胚胎期TSP和ETP的表型及分子特征、群体内部的异质性,乃至T细胞的发育过程仍不清楚。我们的工作利用单细胞转录组测序及无偏颇的生物信息学分析并结合功能实验和组织原位验证,首次从分子层面揭开了人类胚胎期T细胞发育以及胸腺器官形成的神秘面纱;首次在单细胞水平解析了人胚发育早期淋系祖细胞的时空异质性;揭示了TSP起源以及其分子特征;描绘了TSP定植胸腺后历经胸腺定植祖细胞样ETP、增殖活跃ETP、中间态胸腺祖细胞3个阶段进行T谱系命运定向和特化的过程;剖析了胸腺发育早期T细胞及胸腺上皮细胞的异质性和命运特化;勾勒了胸腺器官形成过程中造血细胞和胸腺基质细胞间潜在的相互作用图谱。首先,通过对人胚胎期8-10周胸腺组织的单细胞转录组测序及分析,我们解析了胸腺发育早期的主要细胞类型异质性。值得关注的是,我们识别并揭示了在胸腺血管建立前后,先后进入胸腺的两群ETP群体,即胚期ETP和胎期ETP。它们共同表达祖细胞特征基因CD34和SPINK2,但转录组特征及来源的时间阶段迥然不同。胎期ETP存在于9-10周,而胚期ETP仅仅存在于8周且特异表达CXCL12和TGSP1等趋化及粘附相关特征。这些结果表明9周胸腺血管建立后,进入胸腺的祖细胞群体发生改变[4],并提示在血管建立之前,来自上游造血器官里的祖细胞更多通过趋化运动定植到胸腺原基。随后,通过对胚期5-8周主动脉-性腺-中肾区、胎肝等主要的生血和造血位点以及循环血中造血细胞的单细胞转录组测序及分析,我们首次捕获了人胚发育早期不同时空的CD34+IL7R+淋系祖细胞并解析了它们的转录组特征及群体异质性。通过与胸腺中ETP群体的联合分析,我们发现ETP与8周胎肝中部分淋系祖细胞的转录组表达谱具有高度一致性,首次基于基因表达谱证实了人胚胎期ETP直接来源于胎肝的CD34+IL7R+TSP群体。通过主成分分析和假时序分析,我们进一步揭示了胎肝中的TSP群体定植到胸腺后历经胸腺定植祖细胞样ETP、增殖活跃ETP及中间态胸腺祖细胞3个阶段进行T谱系命运特化的过程及分子调控。系分化潜能。结果表明与成体期不同,人胚胎期CD7+ETP在CD34+CD1A-祖细胞中占绝大多数（75-90%）,且CD7+ETP仍然具有多系分化潜能。随后,通过假时序分析,我们预测并描绘了胸腺中以ETP为发育起点,经历中间态胸腺祖细胞阶段,先后特化为γδT前体细胞和αβT前体细胞的T细胞命运特化轨迹,并绘制了在γδT与αβT命运选择过程中的基因调控网络。同时,我们的研究也首次捕获了人胚胸腺发育早期（8-10周）的胸腺上皮细胞群体,除了明显的上皮特征,它们仍带有第三咽囊的分子特征。通过无监督聚类及降维分析,我们识别了胸腺形成早期的皮质胸腺上皮和髓质胸腺上皮祖细胞群体。通过上皮成熟度评分和相关性分析,我们进一步揭示了皮质胸腺上皮和髓质胸腺上皮成熟速度的显著差异及胸腺上皮细胞成熟的转录调控。随后,通过基因功能富集分析,我们解析了Bmp、Hippo、Wnt、视黄酸及三羧酸循环等重要的信号通路在胸腺上皮细胞特化过程中的差异调控。最后,通过细胞间相互作用分析,我们解析了T细胞发育的胸腺微环境。我们阐明了胸腺微环境中主要的基质细胞与胸腺细胞间不同的相互作用模式,同时我们的研究表明,与内皮细胞和间质细胞相比,胸腺细胞与胸腺上皮细胞之间的相互作用最强。我们的结果显示,CXCL12-CXCR4、CCL25-CCR9等趋化因子信号以及Notch、Bmp和IL-7等淋系发育重要的信号通路在胸腺上皮细胞介导祖细胞的迁移、定植、扩增和分化等过程中具有高度的物种保守性。此外,通过生物信息学预测分析及免疫荧光染色,我们证实了间质细胞和ETP存在IGF2-IGF1R受配体间的相互作用,提示在祖细胞定植胸腺后的增殖及生存过程中,间质细胞可能通过胰岛素样生长因子信号通路也发挥了重要作用。总之,通过对覆盖人胚发育早期主要生血、造血位点及胸腺的单细胞转录组测序和分析,我们首次从分子层面解析了人胚胎期T淋巴细胞的发育和胸腺器官形成的过程。我们的研究将为认识人胚胎期T细胞起源、发育及胸腺器官形成提供宝贵的蓝图和数据资源,也将为指导功能性T细胞的体外再生、胸腺器官重建及再生提供重要的理论依据与支持。