论文部分内容阅读
10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN),是第一个被发现具有磷酸酶功能的抑癌基因,在多种肿瘤中存在突变或缺失。我们前期以小鼠胚胎成纤维细胞系PTEN+/+ MEFs为基础,成功建立了体外条件敲除PTEN基因具有恶性表型的小鼠胚胎成纤维细胞系PTEN-/- MEFs。运用蛋白质组学技术,研究PTEN+/+ MEFs和PTEN-/- MEFs细胞蛋白表达谱的差异。我们发现在PTEN缺失MEFs细胞中同属抗氧化防御系统的铜锌-超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)以及过氧化物还原酶(Prx)5, 6均表达下调。进一步运用Northern blot和Western blot对这一结果进行验证,显示PTEN缺失MEFs细胞中Cu/Zn-SOD和Prx1, 2, 5, 6 mRNA及蛋白表达均下调。抗氧化防御系统包括超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化物还原酶家族(Peroxiredoxins, Prxs)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)以及谷胱苷肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase, GPxs)等,是体内活性氧(ROS)的清除系统。过量的ROS会形成氧化压力(oxidative stress),引发脂质过氧化反应,导致DNA分子的损伤,从而引起基因组不稳定性。正常生理情况下,人体主要依靠抗氧化防御系统来维持ROS的生成与清除之间的动态平衡状态。前期研究结果显示:PTEN-/- MEFs细胞抗氧化防御能力降低;细胞内基础ROS水平升高;细胞脂质过氧化损伤增强;细胞DNA氧化损伤增强。到目前为止,没有任何关于PTEN对Cu/Zn-SOD以及Prxs表达调控机制的报道。对PTEN的功能研究显示:PTEN具有脂磷酸酶的活性,对脂类底物3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)有强去磷酸化作用,而PIP3是PI3K/AKT信号转导通路的主要信号分子。PTEN的缺失可引起PI3K/AKT信号级联的活化,从而刺激细胞增殖与迁移。已知AKT可通过下游的Forkhead家族转录因子FoxO(s包括FoxO1, FoxO3a和FoxO4)对同属于抗氧化防御系统的CAT和Mn-SOD基因转录进行调控。在此调控过程中,AKT对FoxOs的磷酸化可促进FoxOs从核内排出,继而发生降解失活,减弱其在核内的转录调控活性,使CAT和Mn-SOD基因转录水平降低。结合国内外研究进展以及本实验室前期研究发现,我们提出以下假设:PTEN可通过拮抗PI3K/AKT通路对FoxOs转录因子的磷酸化降解途径,进而影响Prx1, 2, 5, 6以及Cu/Zn-SOD的调控和转录。基于上述假设,本研究分三部分进行:1.PTEN是否通过PI3K/AKT/FoxOs通路调控抗氧化防御蛋白的蛋白表达:(1)Western Blot比较PTEN+/+ MEFs和PTEN-/- MEFs细胞基础FoxO1、FoxO3a和FoxO4磷酸化水平以初步判断可能相关的转录因子。(2)Western Blot检测PTEN+/+ MEFs瞬时和稳定转染AKT-WT、AKT-AC质粒以及PTEN-/- MEFs瞬时和稳定转染PTEN-WT、AKT-DN质粒,P-FoxOs和抗氧化防御蛋白的蛋白表达水平差异,确定PTEN是否通过PI3K/AKT通路影响FoxOs在核内的转录调控活性从而调控抗氧化防御蛋白的表达。为进一步明确PTEN通过FoxOs亚家族的哪一个转录因子参与对Prx1, 2, 5, 6和Cu/Zn-SOD表达的调控提供线索。2.检测PTEN是否通过PI3K/AKT通路对细胞内活性氧和抗氧化防御能力产生影响:(1)DCFH-DA(2’7’-二氯荧光素双乙酸盐)和DHE(二氢乙啶)荧光探针分别标记细胞内H2O2及O2·ˉ,结合流式细胞学检测稳定转染AKT-WT、AKT-AC质粒的PTEN+/+ MEFs以及稳定转染PTEN-WT、AKT-DN质粒的PTEN-/- MEFs细胞中DCF和Eth荧光强度,以明确PTEN是否通过AKT通路影响细胞内基础H2O2及O2·ˉ的水平。(2)中性彗星电泳检测PTEN-/- MEFs和稳定转染PTEN-WT质粒的PTEN-/- MEFs细胞内不同浓度H2O2诱发的DNA DSBs水平变化,从而明确重建PTEN表达对MEFs细胞内抗氧化防御能力的影响。3.检测PTEN是否通过PI3K/AKT通路对细胞内DNA双链断裂产生影响:(1)中性彗星电泳检测PTEN-/- MEFs和稳定转染PTEN-WT质粒的PTEN-/- MEFs细胞内DNA DSBs水平;(2)免疫荧光染色检测0.01umol/L H2O2处理15min后,稳定转染AKT-WT、AKT-AC质粒PTEN+/+ MEFs以及稳定转染PTEN-WT、AKT-DN质粒PTEN-/- MEFs细胞按不同时间进行培养,胞核中γH2AX位点数(其直接反映DNA DSBs位点数),从而明确PTEN是否通过AKT通路对细胞内DNA双链断裂水平产生影响。主要结果如下:1. PTEN通过PI3K/AKT通路的活化抑制调控Prx1, 2, 5, 6及Cu/Zn-SOD的蛋白表达:Western Blot结果显示瞬时和稳定转染AKT-WT、AKT-AC质粒的PTEN+/+ MEFs细胞中Prx1,2,5,6和Cu/Zn-SOD蛋白水平明显下调(p<0.01),说明在PI3K/AKT通路失活的PTEN+/+ MEFs中,活化AKT可下调抗氧化防御蛋白的表达。瞬时和稳定转染PTEN-WT/AKT-DN质粒的PTEN-/- MEFs中Prx1,2,5,6和Cu/Zn-SOD蛋白水平上调(p<0.05),说明在PTEN缺失细胞中抑制AKT可使抗氧化防御蛋白的表达增强。以上结果表示PTEN可通过拮抗PI3K/AKT通路调控Prx1, 2, 5, 6及Cu/Zn-SOD蛋白表达。2. PTEN通过拮抗PI3K/AKT通路抑制转录因子FoxO1磷酸化:Western blot结果显示PTEN缺失细胞中转录因子FoxO1和FoxO3a磷酸化水平升高(p<0.01),提示FoxO1和FoxO3a可能参与PTEN对抗氧化防御蛋白的调控;Western blot检测稳定转染AKT-WT/AKT-AC质粒的PTEN+/+ MEFs和稳定转染PTEN-WT/AKT-DN质粒的PTEN-/- MEFs细胞中P-FoxO1蛋白表达,结果表明AKT活化后的PTEN+/+ MEFs细胞P- FoxO1蛋白表达增高(p<0.05),AKT抑制后的PTEN-/- MEFs细胞P- FoxO1蛋白表达显著降低(p<0.01),说明PTEN可通过拮抗PI3K/AKT通路抑制下游转录因子FoxO1磷酸化,维持FoxO1在核内的转录调控活性。3. PTEN通过抑制PI3K/AKT通路降低细胞内基础ROS水平:运用流式细胞仪检测DCFH-DA和DHE探针标记稳定转染AKT-WT/AKT-AC质粒的PTEN+/+ MEFs以及稳定转染PTEN-WT/AKT-DN质粒的PTEN-/- MEFs细胞内DCF和Eth荧光强度,结果显示AKT活化后的PTEN+/+MEFs细胞内DCF和Eth荧光强度明显增高(p<0.05),AKT抑制后的PTEN-/- MEFs细胞内DCF和Eth荧光强度则显著降低(p<0.01)。说明PTEN可通过抑制PI3K/AKT通路降低细胞内基础ROS水平。4. PTEN再表达引起细胞抗氧化防御能力增强:运用中性单细胞凝胶电泳检测发现0.01 mmol/L H2O2作用PTEN-/- MEFs细胞就出现具有统计学意义的平均尾力矩增长(p<0.01),而稳定转染PTEN-WT质粒的PTEN-/- MEFs细胞则在0.05 mmol/L H2O2作用时才出现有统计学意义的平均尾力矩增长(p<0.01)。说明PTEN再表达抑制PI3K/AKT通路会引起MEFs细胞的抗氧化防御能力明显增强。5. PTEN通过拮抗PI3K/AKT通路减少细胞内DNA DSBs水平:中性彗星电泳检测PTEN-/- MEFs和稳定转染PTEN-WT质粒的PTEN-/- MEFs细胞,显示稳定转染PTEN-WT质粒的PTEN-/- MEFs细胞的平均尾力矩(20.34)明显低于PTEN-/- MEFs细胞(27.23)(p<0.01)。说明PTEN再表达可显著降低细胞内DNA DSBs水平。0.01umol/L H2O2作用15min后按不同时间培养,免疫荧光染色显示PTEN+/+ MEFs细胞中γH2AX位点数在30min时即出现了有统计学意义的差异(p<0.05),稳定转染AKT-WT/AKT-AC质粒的PTEN+/+ MEFs细胞则在4h才出现有统计学意义的降低(p<0.05)。PTEN-/- MEFs细胞中γH2AX位点数在4h出现有统计学意义的降低(p<0.05),而稳定转染PTEN-WT/AKT-DN质粒的PTEN-/- MEFs细胞在4h时出现显著的降低(p<0.01)。说明PTEN通过拮抗PI3K/AKT通路促进DNA DSBs损伤的修复,并由此维持基因组稳定性。结论如下:1. PTEN通过PI3K/AKT/FoxOs通路调控Prx1, 2, 5, 6及Cu/Zn-SOD蛋白表达;2.PTEN通过拮抗PI3K/AKT通路降低细胞内基础ROS水平,增强细胞的抗氧化防御能力,减少细胞DNA DSBs损伤水平。说明PTEN在保护细胞免于氧化损伤、维持细胞内氧化还原环境和基因组稳定性方面有着重要作用。