高压技术作为一种新兴的的食品生物技术,能够用在蛋白质构象变化的研究中,有助于揭示蛋白质,特别是酶的功能和构象之间的关系,为酶的定向修饰和改造提供基础。脂肪酶是食品工业应用中最重要的酶类之一。本研究以脂肪酶为研究对象,探索了高压处理后脂肪酶催化行为和构象变化及热稳定性,并利用在线检测装置和分子模拟技术初步探究了高压下酶催化动力学和构象状态,在此基础上探讨了脂肪酶的构效关系。主要研究内容如下:（1）研究了华根霉脂肪酶（RCL）和皱褶假丝酵母脂肪酶（CRL）活力的高压调控。在40℃下,两种脂肪酶的酶活均随压力的升高呈先升后降的趋势。经200 MPa处理10 min后,CRL和RCL水解活力均取得最大值。RCL的酯化活力也在200 MPa达到最大值,而CRL的酯化活力则在300 MPa时达到最大值。CRL催化辛酸己酯的合成反应遵循具有双底物抑制特征的Ping-Pong Bi-Bi机制,高压处理并未改变这一反应机制。（2）考察了纯化后的RCL在高压处理后的构象变化。在0.1⁴00 MPa范围内,RCL二级结构和三级结构的变化较小,脂肪酶处于类天然态,α-螺旋和β-折叠的含量分别维持在45%和25%,内源荧光淬灭常数(K_sv)维持在10.40。当压力升高到500 MPa时,RCL开始折叠展开,α-螺旋含量降低了11%,并伴有构象重排以及三级结构的显著变化,K_sv略微增加。压力在500 MPa以上时,RCL的二级结构部分损失,荧光强度急剧增加,并有红移发生,最大发射波长从331 nm移动到347 nm,三级结构明显损失,部分折叠展开,K_sv增加到12.52。同时,外源荧光强度增加3倍左右,有水分子进入到蛋白质内部,部分疏水区域暴露,结构变得疏松。这些构象变化导致RCL不可逆变性。（3）研究了RCL活性区域在高压下的行为。在0.1²00 MPa下,RCL活性中心上方的盖子与活性中心的距离增加到8.3?,盖子倾向打开,但不影响界面激活;压力由0.1 MPa升高到200 MPa时,活性中心与底物的相互作用略微增强,相互作用能从14.32kJ/mol增加到15.07 kJ/mol。这些变化与RCL构象在该压力范围内的微小变化共同作用,导致RCL酶活增加。在400⁶00 MPa下,盖子与活性中心的距离降低到7.7?,盖子更加闭合;高压也影响了催化残基间的相互作用,如His257和Asp204间的氢键相互作用在600 MPa下变弱;同时,高压处理导致底物和活性中心的亲和能力降低,在600 MPa下其相互作用能降到11.33 kJ/mol;高压处理还可能改变了位于与活性中心相邻的的空腔中Trp224的微环境。这些因素与高压导致的RCL有序结构的损失共同作用,使酶活显著下降。（4）在RCL催化水解对硝基苯酚月桂酸酯的体系中,高压下酶催化能力的变化趋势与卸压后测得的变化趋势相同。在200 MPa高压处理后,最适反应温度为40℃,此时米氏常数和激活体积最低,酶-底物亲和力和催化效率最高。在0.1⁴00 MPa、40℃下,高压处理对RCL界面激活影响很小;而在500 MPa下,界面激活明显变弱。压力—温度共同作用下RCL的热稳定行为表明:在0.1³50 MPa、50⁶0℃范围内压力和温度之间存在拮抗效应;而当压力超过350 MPa后,压力和温度之间呈现促进效应,共同降低了RCL的热稳定性。单价阳离子对RCL酶活的影响基本遵循Hofmeister序列（K⁺>Na⁺>Li⁺）,0.1 mol/L的K⁺和Li⁺都能提高RCL的热稳定性,可能是因为它们改变了RCL的构象;在1.0 mol/L,羟基数目在3及以上的多羟基醇也能通过维持RCL构象起到较好的保护作用。（5）实时在线测定了高压下RCL的构象状态。在50²00 MPa,20⁴0℃范围内,高压下RCL的荧光强度高于常压下,即使卸压后依然比常压下高,表明色氨酸周围的部分变化具有不可逆性。而在60℃下,高压抑制了热处理引起的荧光强度升高,保护了脂肪酶的三级结构,同时也有效保护了其二级结构并保持了盖子结构的完整性,这是RCL在200 MPa,60℃下仍有很高催化能力和热稳定性的主要原因。