论文部分内容阅读
本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)，以内转录间隔区(ITS)作为靶序列设计LAMP特异性引物，建立了我国的5种剧毒鹅膏——裂皮鹅膏(A.rimosa)、致命鹅膏(A.exitialis)、淡红鹅膏(A.pallidorosea)、灰花纹鹅膏(A.fuliginea)、黄盖鹅膏(A.subjunquillea)和欧美的2种剧毒鹅膏——绿盖鹅膏(A.phalloides)、双孢鹅膏(A.bisporigera)共7种剧毒鹅膏的快速检测和鉴定方法;以保守序列5.8S rDNA、部分ITS2作为靶序列设计LAMP通用引物，建立了鹅膏菌属(Amanita)的快速检测和鉴定方法。本研究以羟基萘酚蓝（HNB）作为反应指示剂，建立了LAMP管内可视化检测体系，62℃恒温水浴60 min即可得到反应结果。通过对建立的LAMP检测方法的灵敏性，特异性进行实验分析，获得了以下结果: (1)剧毒鹅膏在蘑菇混合物中的检出限水平可达0.1％，DNA分子的检出限为5.37 pg。 (2)设计的7组特异性引物中，针对裂皮鹅膏、致命鹅膏和灰花纹鹅膏的引物可以特异性区分开7种剧毒鹅膏;而针对淡红鹅膏和双孢鹅膏的2组引物，以及针对黄盖鹅膏和绿盖鹅膏的2组引物，仅两两之间无法区分相应鹅膏，但可以区分其他鹅膏。 (3)设计的1组通用引物可以区分鹅膏菌属与非鹅膏菌属蘑菇种类。以23种鹅膏菌以及19种非鹅膏菌为供试材料进行LAMP反应，23种鹅膏菌DNA的检测结果均为阳性，而19种非鹅膏菌DNA的检测结果均为阴性。 总的来说，本研究所建立的LAMP检测方法简单可视化，具有高特异性和灵敏性，能快速检测和鉴定剧毒鹅膏以及鹅膏菌属，不需要昂贵的设备，可现场应用，对于蘑菇中毒侦查以及医疗人员救治中毒患者具有重要意义。