目的:阿尔茨海默病（Alzeimer disease,AD）是一种慢性隐匿进展且不可逆损害认知功能的年龄相关性脑部退行性疾病,常伴有精神行为异常和日常生活能力障碍。随着人类预期寿命的延长,其患病率逐年增加,严重威胁老年人的身体健康和生活质量,给社会和家庭带来了沉重的经济负担和心理负担。现代研究表明,AD由多因素共同致病,而现有药物仅通过作用于单一靶点来改善AD患者临床症状,不能逆转其病情进展或将其彻底治愈,且随着用药时间的延长,药物诸多不良反应逐渐凸显出来。中医药往往具有多途径、多靶点作用特点,更符合AD的病理机制,因此,发挥中医药优势,积极探索治疗AD有效方剂是AD防治研究的重要途径之一。神经炎症作为AD的重要病理特征及致病因素,能够导致神经元凋亡、血管损伤,具有败坏形体、损伤脑髓的特点,其所发挥的毒性效应,与AD“毒损脑络”学说的内毒范畴相符,因此基于“毒损脑络”理论的中医药中解毒法最具代表的方剂黄连解毒汤及其类方被广泛用于AD的研究。本课题组多年来一直致力于黄连解毒汤治疗老年期痴呆的基础及临床研究,基础研究发现黄连解毒汤能明显改善APP/PS1双转基因AD小鼠的学习记忆能力,能减少模型小鼠脑内Aβ前体蛋白基因和老年斑表达,降低小鼠脑组织及血清IL-6、IL-1β水平;临床研究则发现黄连解毒汤可有效改善老年期痴呆患者的认知和日常生活能力,可有效改善老年期痴呆患者的阳亢、火毒、痰浊症状。但前期研究中存在部分问题,基础研究尚未进一步探讨黄连解毒汤发挥抗炎作用的潜在分子机制;临床研究单用黄连解毒汤治疗AD往往受其苦寒药性所局限。因此基于前期研究成果,本课题分为基础和临床研究两部分,基础研究选择更符合AD病理特点的Tau/APP/PS1三转基因的AD模型小鼠为研究对象,研究黄连解毒汤对其学习记忆能力、组织病理变化、炎性因子的的影响,并进一步研究TLR2/MAPK信号通路相关分子在黄连解毒汤干预中的变化,探讨黄连解毒汤干预AD的潜在分子机制。临床研究则探讨观察组（黄连解毒汤联合洗心汤及多奈哌齐）对比对照组（多奈哌齐）对轻中度痰浊蒙窍证AD患者整体认知功能、日常生活能力、中医证候积分的改善效果,以及对血清炎症指标的影响。方法:1.实验研究本研究将8周龄SPF级Tau/APP/PS1三转基因AD模型小鼠按雄:雌=1:2合笼进行繁殖,选择繁殖后经基因鉴定为Tau/APP/PS1基因型且9月龄的75只雄性小鼠为研究对象,将其随机分为五组:模型组、多奈哌齐组、黄连解毒汤（Huanglian Jiedu Decoction,HLJDT）低剂量组（HLJDT-L）、黄连解毒汤中剂量组（HLJDT-M）、黄连解毒汤高剂量组（HLJDT-H）。各组给予不同的干预措施:模型组给予0.9%生理盐水溶液,多奈哌齐组给予盐酸多奈哌齐水溶液,黄连解毒汤低、中、高剂量组分别予以975mg/kg/d、1950mg/kg/d、3900mg/kg/d不同浓度的黄连解毒汤浸膏水溶液,五组小鼠均连续灌胃给药3个月。灌胃结束后,使用Morris水迷宫实验评价各组小鼠的学习与记忆能力;使用HE染色法观察各组小鼠海马组织CA1区的病理形态改变;使用ELISA法检测各组小鼠海马组织中TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10的表达水平;使用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠海马组织CD86、CD206m RNA的表达水平;使用Western blot法检测各组小鼠海马组织TLR2、My D88、p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达水平。2.临床研究本研究一共入组了符合纳排标准的AD患者58例,将AD患者随机分为对照组和观察组,每组29例,其中对照组给予多奈哌齐治疗,观察组在对照组基础上加用黄连解毒汤联合洗心汤颗粒剂治疗,两组患者均连续治疗24周。以MMSE量表、ADAS-cog量表评估两组患者整体认知功能的变化,以ADL量表评估两组患者日常生活能力的变化;以SDSD量表评估两组患者中医证候积分的变化;以证候积分减少率来判断两组患者的中医疗效;以ELISA法检测两组患者治疗血清炎性因子TNF-α、IL-6的变化。比较两组患者治疗前性别、年龄、受教育程度、病程等基线情况,评估是否具有可比性;比较两组患者治疗前后以及治疗后整体认知功能、日常生活能力、中医证候积分、炎性因子的变化,比较两组患者治疗后中医疗效的差异,评估不同干预药物的疗效及二者的差异。最后评估两组患者服药的安全等级性。结果:1.实验研究（1）黄连解毒汤对Tau/APP/PS1三转基因AD模型小鼠学习记忆能力的影响各组小鼠在进行连续5天的定位航行实验中,其逃避潜伏期呈现下降趋势,均逐渐缩短,提示通过对5组小鼠进行训练,其寻找隐藏水中平台的学习能力均逐渐得到提高。各组小鼠定位航行实验结束即第5天时结果表明,与模型组相比,多奈哌齐组、HLJDT低中高剂量组的逃避潜期均显著减少（P＜0.01）,与多奈哌齐组相比较,HLJDT低剂量组的逃避潜伏期延长,具有统计学差异（P＜0.01）,HLJDT高剂量组、中剂量组的逃避潜伏期无统计学差异（P＞0.05）。空间探索实验结果表明,与模型组相比较,多奈哌齐组、HLJDT低中高剂量组穿越平台次数、目标象限停留时间、目标象限游泳路程均显著增加（P＜0.01）,与多奈哌齐组相比较,HLJDT低剂量组的穿越平台次数、目标象限停留时间、目标象限游泳路程均减少,具有统计学差异（P＜0.05）,HLJDT高剂量组、中剂量组的穿越平台次数、目标象限停留时间、目标象限游泳路程无统计学差异（P＞0.05）。（2）黄连解毒汤对Tau/APP/PS1三转基因AD模型小鼠海马组织病理形态的影响HE染色观察了各组小鼠海马CA1区的组织病理形态,结果显示模型组小鼠海马CA1区神经元细胞数量明显减少,神经元层次排列紊乱,细胞形态异常,细胞核固缩伴染色加深。与模型组相比,多奈哌齐组、HLJDT低剂量组、HLJDT中剂量组、HLJDT高剂量组海马CA1区神经元数量显著增多（P＜0.01）,神经元排列较为规则整齐,细胞形态明显恢复,细胞核固缩现象明显改善。与多奈哌齐组相比,HLJDT低中高剂量组小鼠的海马CA1区神经元排列整齐性,核固缩现象无明显区别,HLJDT中高剂量组小鼠海马CA1区神经元数量显著增多（P＜0.05）,HLJDT低剂量组小鼠海马CA1区神经元数量无统计学差异（P＞0.05）。（3）黄连解毒汤对Tau/APP/PS1三转基因AD模型小鼠海马组织炎性因子表达的影响各组小鼠海马组织中TNF-α表达水平结果显示,与模型组相比,多奈哌齐组、HLJDT低中高剂量组TNF-α的表达水平显著降低（P＜0.01）;与多奈哌齐组相比较,HLJDT低剂量组TNF-α的表达水平无显著差异（P＞0.05）,HLJDT中高剂量组TNF-α的表达水平显著降低（分别为P＜0.05,P＜0.01）;HLJDT不同剂量组比较显示,TNF-α的表达水平随HLJDT剂量的增加而显著降低（P＜0.05）。各组小鼠海马组织中IL-6表达水平结果显示,与模型组相比,多奈哌齐组、HLJDT低中高剂量组IL-6的表达水平显著降低（P＜0.01）;与多奈哌齐组相比较,HLJDT低剂量组IL-6的表达水平无显著差异（P＞0.05）,HLJDT中高剂量组IL-6的表达水平显著降低（均P＜0.01）;HLJDT不同剂量组比较显示,IL-6的表达水平随HLJDT剂量的增加而显著降低（P＜0.01）。各组小鼠海马组织中IL-4表达水平结果显示,与模型组相比,多奈哌齐组、HLJDT低中高剂量组IL-4的表达水平显著升高（P＜0.01）;与多奈哌齐组相比较,HLJDT低剂量组IL-4的表达水平无显著差异（P＞0.05）,HLJDT中高剂量组IL-4的表达水平显著升高（均P＜0.01）;HLJDT不同剂量组比较显示,IL-4的表达水平随HLJDT剂量的增加而显著升高（P＜0.01）。各组小鼠海马组织中IL-10表达水平结果显示,与模型组相比,多奈哌齐组、HLJDT低中高剂量组IL-10的表达水平显著升高（P＜0.01）;与多奈哌齐组相比较,HLJDT低剂量组IL-10的表达水平无显著差异（P＞0.05）,HLJDT中高剂量组IL-10的表达水平显著升高（均P＜0.01）;HLJDT不同剂量组比较显示,IL-10的表达水平随HLJDT剂量的增加而显著升高（P＜0.01）。（4）黄连解毒汤对Tau/APP/PS1三转基因AD模型小鼠海马组织中CD86、CD206m RNA表达水平的影响各组小鼠海马组织中CD86、CD206m RNA的表达水平,结果显示,与模型组相比,多奈哌齐组、HLJDT低中高剂量组CD86m RNA的表达水平显著降低（P＜0.05）,CD206m RNA的表达水平显著升高（P＜0.05）;与多奈哌齐组相比较,HLJDT低中剂量组CD86、CD206m RNA的表达水平无显著差异（P＞0.05）,HLJDT高剂量组CD86m RNA的表达水平显著降低（均P＜0.01）,CD206m RNA的表达水平显著升高（均P＜0.05）。（5）黄连解毒汤对Tau/APP/PS1三转基因AD模型小鼠海马组织中TLR2、My D88、p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达水平的影响各组小鼠海马组织中TLR2、My D88、p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达水平,结果显示,与模型组相比,HLJDT低中高剂量组TLR2、My D88、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白的表达水平显著降低（P＜0.01）,p38、ERK、JNK蛋白表达无显著差异（P＞0.05）,多奈哌齐组上述蛋白表达均无显著差异（P＞0.05）;HLJDT不同剂量组间比较结果显示,小鼠海马组织中TLR2、My D88、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白的表达随HLJDT剂量的增加而显著降低（P＜0.01）,而p38、ERK、JNK蛋白表达无显著差异（P＞0.05）。2.临床研究（1）病例招募完成情况本研究共纳入痰浊蒙窍型轻中度AD病例58例,对照组脱落6例,观察组脱落4例,一共脱落10例,最终完成6个月研究的病例有48例,其中对照组23例,观察组25例,总脱落率为17.2%。（2）基线资料对照组与观察组患者治疗前包括性别、年龄、受教育程度、病程在内的一般资料、痴呆严重程度、认知相关量表评分、日常生活能力量表评分、中医证候积分、血清TNF-α、IL-6水平,组间比较无统计学差异（P＞0.05）。（3）两组治疗前后及治疗24周后各疗效指标比较比较MMSE量表评分,与治疗前相比,两组治疗24周后的MMSE评分具有统计学差异（P＜0.05）。与对照组相比,观察组治疗24周后的MMSE评分具有统计学差异（P＜0.05）。比较ADAS-cog量表评分,与治疗前相比,两组治疗24周后的ADAS-cog评分具有统计学差异（P＜0.05）。与对照组相比,观察组治疗24周后的ADAS-cog评分具有统计学差异（P＜0.05）。比较ADL量表评分,与治疗前相比,两组治疗24周后的ADL评分具有统计学差异（P＜0.05）。与对照组相比,观察组治疗24周后的ADL评分具有统计学差异（P＜0.05）。比较中医证候积分,与治疗前相比,对照组治疗24周后的中医证候积分无统计学差异（P＞0.05）,观察组治疗24周后的中医证候积分具有统计学差异（P＜0.01）。与对照组相比,观察组治疗24周后的中医证候积分具有统计学差异（P＜0.01）。比较中医证候疗效,治疗后对照组总有效率为52.17%,观察组总有效率为88.00%,两组中医证候疗效具有统计学差异（P＜0.05）。比较血清炎性因子水平,与治疗前相比,两组治疗24周后的血清TNF-α、IL-6水平具有统计学差异（P＜0.05）。与对照组相比,观察组治疗24周后的血清TNF-α、IL-6水平具有统计学差异（P＜0.05）。（4）安全性观察两组患者治疗前后生命体征平稳,肝肾功能、血糖、血尿粪常规及心电图,未见明显异常。研究过程中出现了部分不良反应,其中对照组有2例,经对症处理后明显缓解;观察组有3例,症状持续时间短,且耐受性好,未予以处理相关症消失。对照组不良反应发生率为9%,观察组不良反应发生率为12%,两组患者在不良反应的发生并无显著差异（P＞0.05）。进一步比较了两组的安全性,评定结果表明两组无显著统计学差异（P＞0.05）。结论:1.实验研究表明:黄连解毒汤干预可有效改善Tau/APP/PS1三转基因AD小鼠的学习记忆能力、改善海马组织病理形态并保护神经元、改善海马组织的神经炎症、调节海马组织中小胶质细胞的极化、抑制海马组织中TLR2、My D88、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白的表达。综合所有研究结果,我们推测黄连解毒汤能调节小胶质细胞极化,可能通过抑制小鼠海马组织中TLR2、My D88、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白的表达,下调下游促炎因子TNF-α、IL-6的表达,进而发挥保护神经元,改善Tau/APP/PS1三转基因小鼠的学习记忆力的作用。另外不同剂量的黄连解毒汤在不同指标的观测中存在不同差异,但总体来说,中高剂量均优于低剂量,从安全性的角度考虑,中剂量的黄连解毒汤可能是本研究中安全有效的理想剂量,未来需对黄连解毒汤剂量进一步探究。2.临床研究表明:黄连解毒汤联合洗心汤及多奈哌齐治疗AD患者可有效改善其整体认知功能、日常生活能力、中医证候积分,且均优于单用多奈哌齐的对照组。单用多奈哌齐的对照组治疗前后中医证候积分并没有显著变化,说明中医药辅助西药治疗能弥补西药对中医证候改善无效的缺陷。另外黄连解毒汤联合洗心汤及多奈哌齐相较于多奈哌齐治疗AD患者能显著降低其血清炎症因子的表达,说明中医药可能发挥了抗炎作用。