一、研究背景心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）是指因冠状动脉发生部分或完全阻塞后导致心肌缺血,在一定时间内缺血心肌再次恢复正常血流灌注时,心肌损伤反而较前加重的病理过程。其表现形式主要包括心肌舒缩功能障碍以及心肌组织不可逆性损伤等。近年来,随着医学水平的不断提高,体外循环（cardiopulmonary bypass,CPB）技术已经广泛应用于心脏外科领域,采用CPB心脏停搏手术来进行心血管疾病的外科治疗已经成为常态。但因CPB技术所导致的MIRI成为了困扰临床医生的新问题。如何能够降低心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）导致的心肌细胞损伤,从而有效地保护心肌,改善患者预后一直是研究的重要问题。硫化氢（hydrogen sulfide,H₂S）是一种具有生物活性的内源性气体信号分子,与一氧化氮（nitric oxide,NO）和一氧化碳（carbon monoxide,CO）相似,具有持续产生、弥散迅速、作用广泛等特点,参与机体的众多病理、生理进程。内源性H₂S在体内的分布具有器官特异性,在心肌组织中H₂S主要由高表达的胱硫醚γ裂解酶（cystathionine-γ-lyase,CSE）调控合成并发挥病理、生理作用。既往研究已经证实,内源性H₂S具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等多种生物活性,因而在心血管系统中发挥着十分重要的病理、生理作用。在MIRI的过程中H₂S主要通过S-巯基化修饰、调控mi RNA的表达、抗细胞凋亡、抗氧化应激、调节离子通道的活性等机制发挥心肌保护作用。虽然H₂S在IR中的积极作用已经得到证实,但具有剧毒、水溶性质不稳定、与空气混合易爆炸等理化性质阻碍了其作为药物应用于临床的进程。目前对H₂S供体药物的研究主要围绕外源性与内源性H₂S两方面展开,前者以2008年首次合成的新型水溶性H₂S缓释剂GYY4137为代表,尽管外源性H₂S供体易于制备,但缺少靶向效应、稳定性不佳等缺点制约了其进一步临床应用;后者则主要围绕靶向给药技术展开研究。在众多靶向给药技术中,与传统运载系统（如腺病毒、脂质微球等）相比,纳米载体具有低毒、易制备等优点,既能作为水溶性药物载体又能作为脂溶性药物载体。此外,纳米载体具有多种给药途径可供选择,提高药物稳定性之外,有助于实现药物的靶向效应。纳米载药微粒的研制是纳米技术与医药学交叉渗透的新领域,本研究采用纳米载体加载特异性抗体等技术修饰,构建CSE的缺血心肌组织靶向给药系统,使其特异性过表达缺血心肌组织CSE、上调内源性H₂S表达,有望获得疗效确切、安全性佳的新型H₂S供体药物。二、研究目的1、构建CSE心肌靶向纳米载体,明确该纳米载体能否特异性作用于缺血心肌组织,提高IR时心肌局部内源性H₂S水平;2、通过成功构建CSE心肌靶向纳米载体,明确内源性H₂S能否通过对再灌注性心肌细胞线粒体自噬的调控,减轻心肌IR损伤。三、研究方法1、CSE心肌靶向纳米载体的构建:本研究采用带负电荷的靶向肽偶联的量子点（Peptide-PEG-QDs,Pep-QD）和CSE基因质粒载体,与带正电荷的聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）静电组装的方式,使靶向量子点和CSE基因质粒载体组装成纳米团簇,其中带正电荷的PEI具有细胞转染的作用,量子点表面的靶向肽具有靶向定位心肌缺血组织的作用。2、CSE心肌靶向纳米载体靶向定位的验证:取CSE纳米载体注射后大鼠的IR心肌（结扎冠状动脉左前降支（LAD）30min,松解120min后,取左室前壁心肌组织）、非IR心肌、肺、脾、胰腺及主动脉组织,利用Western-blot方法,比较各组织中CSE蛋白表达水平。3、实验对象及分组:选取健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（n=40）并分为以下4组:（1）正常对照组（n=10）:SD大鼠,开胸后缝线穿过LAD下方,不阻断LAD,30min后抽出缝线并关胸,120min后静脉注射生理盐水;（2）IR组（n=10）:SD大鼠,开胸后缝线穿过LAD下方,阻断LAD 30min后松解,恢复血流灌注120min后静脉注射生理盐水;（3）CSE上调组（n=10）:IR后即刻给予静脉注射CSE过表达纳米靶向质粒,使缺血心肌CSE表达上调;（4）CSE下调组（n=10）:构建si RNA,脂质体为载体,局部心肌注射,使缺血心肌CSE表达下调。4、心肌损伤的变化:于术后24h检测大鼠左室功能改变（±dp/dt max）情况,之后处死大鼠进行标本采集。（1）采用TTC染色的方法,苍白区为梗死区（INF）、红染区与苍白区统称为危险区（AAR）、蓝染区为非梗死区,苍白区、红染区与蓝染区之和为左心室面积（LV）。以AAR/LV的比值评价危险面积（%）大小,INF/AAR的比值评价心梗面积（%）大小;（2）利用全自动生化分析仪,检测各组心肌组织中血清LDH、CK-MB和c Tn T含量。5、线粒体自噬的变化:（1）利用RT-PCR方法,比较各组心肌组织中线粒体自噬相关基因（Parkin、Beclin1、Nix）的m RNA表达变化;（2）利用Western-blot方法,比较各组心肌组织中自噬标志蛋白（LC3-Ⅱ、Beclin1、Parkin、Nix）的蛋白表达变化。6、统计学方法:所有数据计量资料采用（Mean±SD）表示,计数资料采用百分比表示。不同组别间计量资料的比较采用单因素方差分析,计数资料的比较采用卡方检验或Fisher确切概率检验。统计学处理采用SPSS 21.0处理。P<0.05认为差异具有统计学意义。四、研究结果1、CSE纳米载体的制备及理化性质的鉴定（1）采用透射电镜观察发现,含巯基的谷胱甘肽分子将油溶性的量子点转移至水相,经水相修饰的量子点具有良好的均一分散性,平均粒径约7-10nm。（2）采用琼脂糖凝胶电泳发现,谷胱甘肽修饰的量子点电泳中迁移距离最远,并且无明显拖尾,说明谷胱甘肽修饰的量子点具有很好的粒径和电荷均一性。经聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）修饰后,量子点的电泳条带稍弥散且迁移距离减小,表明PEG已经修饰到量子点表面,同时对量子点的水合粒径分布有一些影响,但影响不大。进一步再进行靶向肽修饰后,量子点的电泳条带变宽,说明靶向肽可以和PEG修饰后的量子点结合,但会引起部分量子点的聚集。（3）采用琼脂糖凝胶电泳发现,当PEI/QD的摩尔比（N/P）为0.2时,几乎全部的量子点阻滞在电泳的上样孔中,说明在该N/P下PEI的量足以使量子点完全通过静电自组装的方式完全团聚,最终我们选择适当过量PEI/QD的N/P为0.3的比例来制备DNA载体团簇。（4）采用琼脂糖凝胶电泳发现,固定DNA质粒的数量,调整PEI-QD/DNA的N/P为0.5时,大部分质粒已经被包裹进量子点团簇中。2、CSE纳米载体靶向定位的验证经Weston-blot方法分析,与非IR处心肌、肺、脾、胰腺及主动脉组织相比,CSE纳米载体注射大鼠后IR处心肌组织的CSE蛋白表达含量明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,证实CSE纳米载体能够特异性作用于IR处心肌组织,提高IR处心肌组织CSE表达水平。3、心功能指标的变化（1）在阻断LAD前,正常对照组、IR组、CSE上调组与CSE下调组的心功能指标（±dp/dt max）各组间无差异（P>0.05）;（2）术后24h,与正常对照组相比,IR组的±dp/dt max显著下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,提示心肌IR对心肌的舒缩功能具有抑制作用;与IR组相比,CSE上调组的±dp/dt max显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,证实CSE心肌靶向纳米载体注射大鼠后,IR处心肌组织局部H₂S水平的提高能够减轻IR对心肌舒缩功能的抑制作用。4、心肌坏死及形态学的变化（1）与正常对照组相比,IR组的心梗面积（%）明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）,提示心肌发生IR对心肌能够产生明显损伤;（2）与IR组相比,CSE上调组与CSE下调组的危险面积（%）的差异均无统计学意义（P>0.05）;CSE上调组的心梗面积（%）明显下降,CSE下调组的心梗面积（%）明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,证实CSE在心肌组织的高表达对于IR导致的心肌损伤具有保护作用,CSE心肌靶向纳米载体能够使CSE高表达于IR处的缺血心肌,降低心肌坏死面积,减少心肌损伤。5、心肌损伤标志物的变化（1）与正常对照组相比,IR组的血清LDH、CK-MB和c Tn T含量均显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,提示心肌IR能够对心肌细胞造成明显损伤;（2）术后24h,与IR组相比,CSE下调组的血清LDH、CK-MB和c Tn T含量均显著升高,CSE上调组的血清LDH、CK-MB和c Tn T含量均显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,证实CSE心肌靶向纳米载体注射大鼠后,IR处心肌组织局部H₂S水平的提高能够减轻IR对心肌细胞的损伤。6、线粒体自噬相关基因m RNA水平的变化（1）经RT-PCR方法测定,与正常对照组相比,IR组的心肌细胞自噬相关基因Parkin、Beclin1、Nix的m RNA表达明显上调,差异具有统计学意义（P<0.05）,提示心肌IR能够对心肌细胞自噬相关基因的m RNA表达产生影响;（2）术后24h,与IR组相比,CSE下调组的心肌细胞自噬相关基因Parkin、Beclin1、Nix的m RNA表达明显上调,CSE上调组的心肌细胞自噬相关基因Parkin、Beclin1、Nix的m RNA表达明显下调,差异具有统计学意义（P<0.05）,证实CSE心肌靶向纳米载体注射大鼠后,IR处心肌组织局部H₂S水平的提高能够减少IR对心肌细胞自噬相关基因的m RNA表达。7、线粒体自噬相关基因的蛋白水平的变化（1）经Western-blot方法测定,与正常对照组相比,IR组的心肌细胞自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、Parkin、Nix蛋白表达明显上调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大,差异具有统计学意义（P<0.05）,提示心肌IR能够对心肌细胞自噬标志蛋白的表达产生影响;（2）术后24h,与IR组相比,CSE下调组的心肌细胞自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、Parkin、Nix蛋白表达明显上调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大;CSE上调组的心肌细胞自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、Parkin、Nix蛋白表达明显下调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值减小,差异具有统计学意义（P<0.05）,证实CSE心肌靶向纳米载体注射大鼠后,IR处心肌组织局部H₂S水平的提高能够减少IR对心肌细胞自噬标志蛋白的表达。五、研究结论1、CSE心肌靶向纳米载体能够特异性作用于IR处的心肌组织,提高缺血心肌局部内源性H₂S水平;2、H₂S能够减轻IR对心肌舒缩功能的抑制作用,减少因IR导致的心肌坏死与心肌细胞损伤;3、H₂S能够通过对再灌注性心肌细胞线粒体自噬相关基因Parkin、Beclin1、Nix的m RNA和心肌自噬标志蛋白LC3-II、Beclin1、Parkin、Nix蛋白的调控,减轻心肌IR损伤。