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为了构建一个高效的经改造后的人胰岛素基因乳腺特异性表达载体,从而为利用动物乳腺生产人成熟胰岛素打下基础,我们利用Long PCR技术克隆了长为5151 bp的山羊β酪蛋白基因5′调控区,并且在克隆出改造后的人胰岛素基因的基础上,以奶牛β酪蛋白基因调控区为指导元件,以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,构建了人胰岛素基因的乳腺特异性表达载体pEBH,为利用动物乳腺生物反应器生产人成熟胰岛素的研究打下了坚实的基础。研究结果如下:1.利用Long PCR技术成功从人基因组中扩增出长度为1696 bp人胰岛素基因,又以人胰岛素为模板分三段扩增出长度为262 bp的A肽、218 bp的B肽、928 bp的C肽,连接C肽和A肽。其中包含有完整的编码序列。序列分析表明,片段和GenBank中公布的人胰岛素基因DNA序列的同源性为99%,尽管有三处发生了碱基突变,但不在主要功能区并没有改变蛋白的功能。2.根据表达载体pEGFP-C1上的多克隆位点以及质粒pBL中的CSN2启动子序列设计引物,在引物两端添加酶切位点,采用定向克隆的方法,成功的将HBCA基因与CSN2调控序列融合在一起。3.采用定向克隆的方法,利用真核表达载体pEGFP-C1构建了含有报告基因的人胰岛素乳腺特异性表达载体pEBH。载体含有抗性基因和绿色荧光蛋白(EGFP)基因,且报告基因和目的基因表达为非融合型表达。4.用脂质体法将表达载体pEBH转染体外培养的山羊乳腺上皮细胞,经G418初步筛选,通过荧光显微镜观察到报告基因的表达。通过PCR检测,表明HBCA基因序列已存在山羊乳腺上皮细胞染色体中。5.采用Long PCR法,克隆了山羊CSN2基因长为5151bp的5′调控区。经NCBI blastn软件进行同源性序列分析,结果表明:所克隆的片段与山羊CSN2基因对应区段的同源性均为99%,证明为山羊β酪蛋白基因的5′调控区。利用本试验克隆的5′调控区和本实验室已有的长为6.6 kb的3′调控序列,可以构建高效的乳腺特异性表达载体。