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第一部分弓形虫多表位疫苗研究1．疫苗的制备构建弓形虫多表位基因在真核表达系统中的表达质粒pCDNA3-MAG。以试剂盒大量纯化质粒pcDNA3-MAG、pcDNA3-SAG1和pcDNA3，用于制备核酸疫苗。以脂质体作为免疫佐剂，增强疫苗的免疫效果。诱导并纯化弓形虫MAG的原核表达重组抗原(rMAG1)、SAG1的原核表达重组抗原(rSAG1)及载体质粒pET32a表达的硫氧还蛋白(Trx)，作为DNA疫苗的加强免疫疫苗。2．动物免疫以BALB／C小鼠为免疫对象，按照疫苗的构成和免疫方式不同，将实验动物分为DNA疫苗免疫系列和“基础-加强”免疫系列，前者均以MAG的DNA疫苗进行免疫，后者先以MAG的DNA疫苗免疫，再以重组抗原rMAG进行增强免疫。每系列均设SAG1免疫组、载体对照组和空白对照组。3．免疫应答及免疫保护性小鼠免疫前及末次免疫后第1周、第3周、第5周，分别采集血清，以ELISA试剂盒检测各组小鼠的抗弓形虫IgG抗体、IFN—γ和IL—4含量，末次免疫后6w，以RH株弓形虫速殖子感染小鼠(200个／只)，统计各组小鼠的存活时间和存活率。综合各项检测指标进行统计分析后，结果如下：DNA疫苗实验结果显示，同免疫前、载体对照组和空白对照组相比，MAG的DNA疫苗刺激小鼠产生了特异性抗弓形虫IgG抗体和高水平IFN—γ，而与SAG1组比较，无显著性差异；在对抗致死剂量弓形虫的感染上，同SAG1免疫组、载体对照组和空白对照组相比，MAG组小鼠不仅延长了存活期，还有1只存活90天以上(存活率为8.3％)。DNA疫苗初免、重组抗原疫苗加强免疫的实验结果显示，同免疫前、载体对照组和空白对照组相比，MAG组小鼠产生了特异性抗弓形虫IgG抗体和高水平IFN—γ，与SAG1组比较，IFN—γ含量无显著性差异，但IgG抗体水平有显著差异，MAG组高于SAG1组；在对抗致死剂量弓形虫的感染上，同载体对照组和空白对照组相比，MAG组小鼠不仅显著延长了存活时间，还有4只存活90天以上(存活率为33.3％)，同SAG1免疫组相比，小鼠存活时间无显著性差异，但存活率高于SAG1组的16.7％。就MAG疫苗的两种不同免疫方式——DNA疫苗单独免疫和DNA疫苗初免、重组抗原疫苗加强免疫——进行比较，二者激发的体液、细胞免疫存在非常显著性差异，后者显著高于前者；在对抗致死剂量弓形虫的感染上，两组小鼠的存活时间具有非常显著性差异，后者显著高于前者；两组均有小鼠存活存活90天以上，前者为1只，存活率为8.3％，后者存活4只，存活率为33.3％。结果显示先以DNA疫苗初免、再以重组抗原疫苗加强免疫，较单纯DNA免疫，获得了更好的免疫保护效果。实验中，以弓形虫强保护性抗原SAG1(P30)作为多表位疫苗的平行对照，结果表明多表位疫苗的免疫效果在整体上优于SAG1基因疫苗，尽管后者也获得了较好的免疫保护性(如以其基因的DNA疫苗初免、以其重组抗原疫苗加强，使免疫的小鼠获得了16.7％的存活率)。为了验证弓形虫多表位疫苗在免疫小鼠后各表位的表达和呈递，分别制备了三种重组抗原rSAG1、rGRA2、rROP2，以Western-blot检测小鼠免疫血清和上述重组抗原的特异性结合反应。结果显示，以两种方式免疫后的小鼠血清，均可被上述三种重组抗原所特异识别，表明多表位基因所包含的表位在小鼠体内得到了有效的表达和呈递，并激发了特异的体液免疫反应。本实验中，以弓形虫RH株感染小鼠，空白对照组小鼠在7天内全部死亡。而以MAG的基因疫苗免疫小鼠，小鼠的存活时间显著延长，且有8.3％的小鼠存活90天以上；以DNA疫苗初免、重组抗原疫苗加强免疫小鼠，33.3％的的小鼠存活90天以上。以上结果表明该疫苗具有良好的免疫保护性，验证了以多表位的方法制备弓形虫病疫苗、以复合免疫的方式增强免疫效果的可行性。第二部分重组多表位抗原在免疫诊断中的初步应用1．弓形虫感染小鼠血清的制备及鉴定以B36株弓形虫感染小鼠，采集血清，以ELISA和Western—blot检测抗弓形虫IgG抗体，直接镜检脑内包囊或腹腔速殖子，共获得17只小鼠的感染血清，效价最高可达1：51200。2．弓形虫多表位重组抗原的可溶性表达、纯化及鉴定大量诱导表达可溶性的弓形虫多表位重组抗原(rMAG)，以Ni-NTA agarose和割胶电渗对其进行两步法纯化，最后得到了纯度达95.86％的rMAG。免疫印迹实验证明，弓形虫多表位重组可溶性抗原不仅能够被弓形虫强毒株RH感染的兔血清及抗弓形虫速殖子主要表面抗原SAG1(P30)的单抗所识别，而且能被成囊株弓形虫B36株慢性感染的小鼠血清所识别，提示该抗原既含有弓形虫速殖子抗原表位，也含有缓殖子包囊抗原表位。3．弓形虫多表位重组抗原在检测弓形虫感染中的应用以弓形虫感染血清为一抗，筛选重组弓形虫多表位抗原的最佳包被浓度为3μg／ml，用于制备ELISA检测试剂盒。检测小鼠血清141份，其中阳性小鼠感染血清为117份、正常小鼠血清24份，结果显示，该试剂盒敏感性为88.88％(104／117×100％)，特异性为91.67％(22／24×100％)，一致性为89.36％((104+22)／141×100％)。检测兔血清24份，其中急性感染弓形虫的兔血清18份，正常兔血清6份，阳性血清检出率为94.4％，总一致性为91.5％((17+5)／24×100％)。以上结果显示，弓形虫多表位抗原试剂盒既可以检测弓形虫急性感染血清，又可以检测弓形虫慢性感染血清，初步证实了多表位抗原用于弓形虫感染诊断中的优势，为试剂盒的下一步应用奠定了基础。