结球甘蓝是我国的一种重要蔬菜，栽培面积已达几十万公顷，但结球甘蓝病害相当严重，常给广大菜农造成极大经济损失。在我国，有关结球甘蓝的抗病育种研究取得．了很大的进展，已选育出不少抗性材料和抗性较强的品种，在现有的抗病材料中，有些材料往往伴随着经济性状不良而难应用于生产，且用常规的方法难以打破它们的连锁关系。传统的防治病害的方法仅在一定范围内有效，而且都有其局限性，如种子消毒，用化学农药防治既费时费工，又造成环境污染。随着现代生物技术的不断发展，分子生物学研究的不断深入，利用植物基因工程手段来辅助植物抗病育种显示出巨大潜力，把外源抗性基因导入到农作物品种中，增强其对病害的抗性成为可能，从而可以大大加速植物抗病育种进程，开辟了植物抗病基因工程的新时代。建立一个比较完整的cDNA文库，是开展分子生物学研究的基础工作，是分离特定基因，特别是分离高等真核生物基因的有效手段，目的基因的克隆对于研究基因结构，调节机制等方面有十分重要意义。结球甘蓝作为我国一种重要的蔬菜作物，其分子生物学研究方面远滞后于一些大田作物，为了分离结球甘蓝的一些有用基因，本研究构建了结球甘蓝的eDNA文库，并对该文库的部分特性进行了研究。到目前为止，已有一些通过分离克隆植物抗病基因，把抗病基因导入到抗性弱的作物中，以增强其抗性的报道很多，已在玉米，番茄，亚麻，拟南芥，水稻，甜菜，小麦等作物中，成功克隆出许多抗病基因，这些抗病基因表现出对病毒，细菌，真菌或线虫抗性。克隆这些基因主要采用图位克隆法和转座子标签法，这两种方法均需投入大量的人力，物力，耗时，而利用同源序列法分离抗病基因显示出经济，快速的优点，根据抗病基因保守序列设计简并引物，然后用PCR法从抗病材料的基因组或cDNA中扩增出应用于分离抗病基因的探针，对用含抗病基因的材料构建的cDNA文库进行筛选，进而克隆出抗病基因。在本实验中，亦是利用同源序列法，对构建的含抗病基因的cDNA文库进行筛选，分离出一个候选抗病基因，并对其序列以及其编码的氨基酸序列，蛋白质特性和结构预测方面进行了分析研究，同时对该基因亦进行了芥菜的遗传转化的初步探讨。获得了以下结果：1．构建结球甘蓝cDNA文库按SMART cDNA文库构建试剂盒说明进行操作，文库的宿主菌为大肠杆菌XLl—BLue，对文库的部分特性研究结果为：扩增后，文库滴度为4X10~8pfu/ml，插入片段大小均在500bp以上，以1kb的片段占大多数，文库重组体的重祖率为95％，并对该文库进行了扩增，保存。该文库的指标均达到普通文库所需的要求，能够利用该文库进行结球甘蓝目的基因的分离和克隆。2．结球甘蓝抗病基因片段的分离 参照烟草的抗花叶病毒基因N，拟南芥的抗丁香假单抱杆菌基因RPSZ及亚麻的抗叶锈病基因L6的保守区域设计简并引物，其中5’端引物为：5’七 上＼3’端引物为：5’－A（A／G）IGCTA（A／G）IGGIA（A／G）ICC－3’。采用 PCR热启动法，分别从高抗TCWi甘蓝材料84075幼苗的CDNA第一条链及基因组中扩增出一条约510hp左右的DNA条带，把PCR产物经纯化回收后，采用T／A克隆法，用T4连接酶连接PUCIU－T载体，转化大肠杆菌DHS。，利用a－互补筛选重组子，进一步通过PCR及酶切验证，表明目的片段己克隆进入质粒载体中。3．抗病基因片段的测定及分析 分别对RT－－PCR产物及基因组DNA eR产物克隆成功的重组子进行测序，分析，挑取两个与己克隆的抗病基因同源性比较高的重组子作探针，命名为Borl，BorZ，二者的片段大小为sl3bP，编码171个氨基酸，二者的核昔酸一致性为刀．3兄氨基酸的一致性为61．4儿它们与拟南芥抗丁香假单抱杆菌基因RPSZ同源性最高。4．从叨NA文库筛选目的基因及目的基因序列分析 以Bor，BorZ基因片段为探针，用DIG进行标记，对cDNA文库进行筛选，获得一个阳牲克隆，命名为TURZ，对所得的阳性克隆进行测序和序列分析，结果表明该基因片段大小为762昨，编码226个氨基酸，含有一个68foP的由起始密码子肌G和终止密码子TAA组成的开放阅读框，含有抗病基因保守特征区域雌S的卜环（GGVGM’T）和mR（GLPLAL）区。与基因库的己知抗病基因序列进行比较，结果如下：与甘蓝型油菜的抗病基因同源序列RGA13，结球甘蓝的抗病基因同源序列RGAS，拟南芥的一个类似于N的抗病基因，RPS4基因，一个未命名抗性基因，菜豆的抗病基因同源序列SBS，0B3，大豆的抗病基因同源序列e23，MG63和oh6基因，亚麻的幻基因，L6基因有不同程度的同源性，分别为：7Ch，80％，44％，33％，3gy，33％，51％，肛说，34％，30％，Zthe，29％，与甘蓝型油菜，结球甘蓝的抗病基因片段同源性较高。TuRZ与Borl，BorZ的核昔酸同源性分别达65．2％，76．4％。5．目的基因的Southern杂交和共分离检测 用 TURZ作探针，提取抗病材料84075的DNA，经ede，Ladll，局丑 I，Hholll，SaCI，edi V等酶切后，经电泳，转膜后，进行 Southern杂交和 RFLP分析，结果为：除 edeI酶切，杂交只出现一条杂交带外，其他酶切结果均出现2条以上的杂交?