丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是慢性肝脏疾病的主要病因。据世界卫生组织统计,全球约有1.85亿丙型肝炎病毒感染者,感染率约3%。我国的HCV感染率呈逐年上升,2013年报告病例数超过22万人。前瞻性研究显示80%的急性丙型肝炎患者可进展为慢性感染,HCV感染20-30年后,可导致肝硬化,肝衰竭及肝细胞癌。据估计到2025年,HCV相关的死亡率将增加3倍,是引起慢性肝脏疾病死亡的重要原因之一,严重危害人类健康。肝纤维化作为慢性HCV感染进展为肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌的重要病理过程。因此,肝纤维化的早期诊断及有效的抗纤维化治疗是阻止该病进展的重要措施。目前肝穿刺组织病理学检查是诊断肝纤维化分期的金标准,但由于标本量限制及有创性,不适宜反复进行,且部分患者不易接受。因此,迫切需要探寻准确判断肝纤维化分期及进展的分子生物学标志物。微小RNAs(microRNAs,miRNAs/miR)是一类内源性非编码单链小RNA,可通过与靶mRNA的3’端非翻译区(untranslated region,UTR)结合,抑制mRNA翻译,对基因转录后水平进行负性调控。miRNAs参与体内正常细胞的生长、分化及增殖。大量研究表明miRNAs可参与细胞外基质成分的沉积及调节纤维化相关的信号通路。特异性阻断或促进相关miRNAs表达可能逆转肝纤维化的形成。因此,差异表达的miRNAs在HCV相关肝纤维化中的作用及分子机制有待进一步研究。本研究采用慢性HCV感染病例及建立HCV相关肝纤维化细胞模型,观察差异表达miRNAs与HCV相关肝纤维化发生发展的关系,预测其靶基因及主导信号转导通路,阐明靶向调节miRNAs及其靶基因在HCV相关肝纤维化中的作用及分子机制,并进一步通过临床病例验证差异表达miRNAs对丙型肝炎肝纤维化分期的诊断价值,以为该病早期诊断提供敏感、特异的新型分子诊断标志物,为临床上从基因水平诊断及防治该病提供新途径及科学依据。第一部分hcv相关肝纤维化患者血清差异表达mirna的筛选、验证及靶基因预测目的:筛选hcv相关肝纤维化患者血清中差异表达的mirnas,验证及靶基因预测。方法:选择河北医科大学第三医院的慢性hcv感染者61例,另选与性别、年龄匹配的健康体检者20例作为对照组,留取血清备用。慢性hcv感染者均由血清学及肝组织病理学确诊,根据metavir评分系统将hcv患者分为轻度纤维化组(f<2,n=27)和中至重度纤维化组(2≤f<4,n=34)。另选5例肝移植供体作为健康对照组。血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,alt)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,ast)水平采用酶法检测;肝组织切片行苏木素-伊红(haematoxylinandeosin,he)染色及masson三色染色,观察肝组织纤维化程度;采用lcsciencesmicrorna基因表达谱芯片筛选hcv相关肝纤维化差异表达mirnas,采用实时定量pcr进行验证;原位杂交方法检测肝组织中mirna的表达情况;采用生物信息学3种软件对mirna的靶基因进行共同预测,并用双荧光素酶报告基因实验进行验证。结果:1一般情况:健康对照组(n=20),其中男性8例,女性12例,平均年龄(48±9.7)岁;hcv感染患者f<2组(n=27),其中男性11例,女性16例,平均年龄(47.44±11.8)岁;hcv感染患者2≤f<4组(n=34),其中男性15例,女性19例,平均年龄(52.40±7.8)岁。三组年龄之间差异无统计学意义(f=2.006,p=0.141)。2血清alt、ast水平:健康对照组、hcv感染患者f<2组及hcv感染患者2≤f<4组血清alt中位数分别为25.5、48、31u/l,三组之间差异具有统计学意义(z=6.262,p=0.044);血清ast中位数分别为23.5、38、44u/l,三组之间差异具有统计学意义(z=29.511,p=0.000)。两两比较结果显示,hcv感染患者f<2组、2≤f<4组血清alt显著高于健康对照组(p=0.032,p=0.005);hcv感染f<2组、2≤f<4组患者血清ast均显著高于健康对照组(均p=0.000)。3肝组织病理学特征:健康对照组肝小叶结构正常,hcv感染者f<2组肝组织可见肝细胞轻度水样变,窦周轻度纤维化,少量纤维化组织增生;2≤f<4组可见肝细胞中至重度水样变,可见窦周纤维化;汇管区扩大,纤维组织增生明显,纤维间隔形成。4mirnas芯片结果:采用mirnas芯片筛选hcv相关肝纤维化患者血清中差异表达的mirnas,筛选出41个差异表达mirnas,其中表达上调的有30个(has-mir-7977,has-mir-1273g-3p等),下调的有11个(has-mir-191-5p,has-mir-4289等)。5mirnas的验证及相关性分析:应用实时定量pcr方法检测,结果显示hcv相关肝纤维化患者血清中mir-1273g-3p表达较对照组明显上调,与芯片结果一致(p<0.05),sperman相关分析mir-1273g-3p与肝纤维化分期呈正相关(r=0.601,p=0.000)。应用原位杂交技术检测到hcv相关肝纤维化肝组织中mir-1273g-3p表达随着肝纤维化的进展其表达明显增多。6mir-1273g-3p的靶基因预测:应用3种靶基因预测软件预测mir-1273g-3p的靶基因,其中10号染色体缺失性磷酸酶张力蛋白同原物基因(phosphataseandtensinhomologydetetedonchromosometen,pten)3’utr区存在mir-1273g-3p的结合位点并应用双荧光素酶报告基因实验进行验证。结论:1hcv相关肝纤维化患者血清中mirnas差异表达明显,提示mirnas可能参与了该病的进展。2血清mir-1273g-3p在hcv相关肝纤维化患者表达较正常组明显上调,并在中至重度肝纤维化患者进一步升高,且与肝纤维化分期呈正相关。3mir-1273g-3p能与pten特异性结合,提示pten为mir-1273g-3p的靶基因。第二部分mir-1273g-3p在体外活化肝星状细胞中的表达变化目的:建立稳定表达hcv核心蛋白的hepg-core细胞系,探明mir-1273g-3p在肝星状细胞(hepaticstellatecell,hsc)活化中的作用。方法:将pcdna3.1-hcv核心蛋白质粒转染至hepg2细胞,构建稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系并用实时定量pcr和westernblot进行验证;酶联免疫吸附实验检测hepg2细胞上清液中转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,tgf-β1)水平。将细胞培养上清液作为条件培养基处理人肝星状细胞系lx-2,检测lx-2中mir-1273g-3p及靶基因pten的表达变化;实时定量pcr,westernbolt及免疫细胞荧光染色方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)、?型胶原α1(alpha-1typeicollagen,col1a1)及tgf-β1表达;细胞增殖-毒性检测试剂盒(cellcountingkit8,cck-8)检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。结果:1成功建立稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系:与对照hepg2-nc细胞相比,hepg2-core细胞能够稳定表达hcvcoremrna和蛋白;培养上清液中tgf-β1水平显著升高。2hepg2-core细胞培养上清液作为条件培养基可促进hsc活化及增殖,抑制其凋亡:hepg2-core细胞培养上清液促进lx-2细胞α-sma、col1a1及tgf-β1mrna及蛋白表达显著增加,促进lx-2细胞的活化及增殖,抑制lx-2细胞的凋亡。3在活化的hsc中,mir-1273g-3p表达显著增加,靶基因pten表达显著下调:mir-1273g-3p在表达hepg2-core细胞培养上清液诱导活化的hsc中表达显著上调,靶基因pten随着hsc的活化其表达显著减少。结论:1稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞上清液可作为条件培养基促进lx-2细胞活化及增殖,抑制其凋亡。2mir-1273g-3p在活化的hsc中升高,靶基因pten表达下调。第三部分靶向调控mir-1273g-3p及靶基因pten对肝星状细胞活化的影响及作用机制目的:明确过表达及抑制mir-1273g-3p及其过表达靶基因pten对活化hsc的影响及分子生物学机制。方法:应用肝星状细胞系lx-2细胞,将50μmmir-1273g-3pmimic、100μminhibitor及各自的对照组,过表达载体pten及对照组转染至lx-2细胞;采用cck-8测定各组细胞活力,采用实时定量pcr及westernblot检测mir-1273g-3p,靶基因pten及下游信号因子,肝纤维化相关基因的表达情况。结果:1抑制或过表达mir-1273g-3p对hsc活化、增殖及凋亡的影响:抑制mir-1273g-3p能够显著抑制α-sma、col1a1及tgf-β1mrna及蛋白的表达;cck-8结果显示,转染100μmmir-1273g-3pinhibitor后,lx-2的细胞活力明显降低;pi标记的流式细胞仪检测,应用mir-1273g-3p抑制剂后,lx-2的细胞凋亡率明显增多。过表达mir-1273g-3p后上述结果呈相反趋势。2抑制或过表达mir-1273g-3p对靶基因pten、下游信号通路因子及纤维化因子的影响:抑制mir-1273g-3p后,靶基因pten的蛋白表达明显增多,mrna的表达无明显差异;其下游akt的表达明显减少;促凋亡指标bad、bax、caspase9/3及parp的表达明显增多,抗凋亡指标bcl-2的表达明显减少。过表达mir-1273g-3p后,靶基因pten的表达明显减少,下游因子akt的表达明显增多,促凋亡指标bad、bax、caspase9/3及parp的表达明显减少,抗凋亡指标bcl-2的表达明显增多。3过表达靶基因对pten、下游信号通路因子及肝纤维化因子的影响:过表达pten后,pten的表达水平明显上调,同时下游基因akt的mrna水平及p-akt蛋白水平表达下调;促凋亡指标bad、bax、caspase9/3及parp的表达显著上调,抗凋亡因子bcl-2表达水平下调;肝纤维化因子α-sma、col1a1及tgf-β1的表达水平表达明显减少,lx-2细胞的凋亡率明显增加。结论:1抑制mir-1273g-3p能够减少hsc的活化、增殖及胶原分泌,促进hsc的凋亡。2抑制mir-1273g-3p能够上调hsc内靶基因pten的表达,抑制下游因子akt的表达,进而促进hsc凋亡。3过表达pten可抑制hsc的活化及增殖,促进hsc的凋亡。第四部分mir-1273g-3p对丙型肝炎肝纤维化分期的诊断价值目的:对比分析mir-1273g-3p、lsm、arpi及fib-4与肝纤维化分期的相关性及受试者曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,roc)下面积,明确mir-1273g-3p诊断丙型肝炎肝纤维化分期的价值。方法:肝穿证实慢性丙型肝炎患者112例,均于肝穿前后1周,同步检测肝脏生化、外周血小板计数及fibrotouch检测肝脏硬度值(liverstiffnessmeasurement,lsm),根据metavir纤维化评分系统分成3组(f<229例,2≤f<447例,f=426例),外周血血小板(platelet,plt)采用自动五分类血细胞分析仪检测;采用olympus全自动生化分析仪检测肝脏生化指标;apri和fib-4指数按公式进行计算;spearman分析mir-1273g-3p、lsm、apri和fib-4与肝组织病理学分期的相关性;采用roc曲线对比分析mir-1273g-3p、lsm、apri和fib-4诊断不同纤维化分期的诊断效能。结果:1患者的一般情况:慢性丙型肝炎患者112例,f<2组39例,其中男性17例,女性22例,平均年龄(43±12.42)岁;2≤f<4组47例,其中男性22例,女性25例,平均年龄(52.29±9.54)岁;f=4组26例,其中男性17例,女性9例,平均年龄(55.19±10.18)岁,三组之间年龄的差异具有统计学意义(χ2=12.294,p=0.000),两两比较结果显示,2≤f<4组及f=4组间年龄无显著性差异(p=0.274),但高于f<2组(p值均为0.000)。2血清酶学水平:f<2组、2≤f<4组及f=4组血清alt中位数为31.5、33、38.4u/l,三组之间alt差异无统计学差异(χ2=1.604,p=0.199);f<2组、2≤f<4组及f=4组血清ast中位数为34、39、48.5u/l,三组之间ast差异无统计学差异(χ2=1.175,p=0.245);f<2组、2≤f<4组及f=4组血清tbil中位数为12.7、13.9、17.31μmol/l,三组之间tbil差异有统计学差异(χ2=5.603,p=0.035),f=4组血清tbil中位数高于f<2组、2≤f<4组(p=0.002,p=0.004);f<2组、2≤f<4组及f=4组血清plt中位数为183×109/l,149.6×109/l,125×109/l,三组之间plt差异有统计学差异(χ2=13.518,p=0.000),f=4组及2≤f<4组血清plt水平低于f<2组(p=0.001,p=0.000);f=4组血清plt水平低于2≤f<4组(p=0.021)。3mir-1273g-3p、lsm、fib-4及apri与丙型肝炎肝纤维化分期的相关性:以肝组织病理学分期为依据,spearman相关分析了血清mir-1273g-3p的表达与肝纤维化的分期呈正相关(r=0.657),lsm,apri和fib-4与肝组织病理学也显出很好的相关性(r=0.815,0.417,0.522)。4对比分析mir-1273g-3p,lsm,fib-4及apri对丙型肝炎肝纤维化分期的诊断价值及影响因素:ROC下面积结果显示miR-1273g-3p诊断肝纤维化分期S≥2,S=4的ROC曲线下面积分别为(0.841,0.933),明显高于FIB-4(0.791,0.766)和APRI(0.719,0.760),低于LSM(0.890,0.937)。Spearman相关分析显示:miR-1273g-3p与年龄,体重指数,ALT,AST及TBIL呈正相关,相关系数r分别为0.396,0.219,0.215,0.228及0.225(P<0.05),与PLT呈负相关r=-0.318(P<0.05)。结论:1血清miR-1273g-3p与肝纤维化的病理分期呈正相关。2血清miR-1273g-3p对明显肝纤维化及早期肝硬化的诊断有较高的价值。