衰老是一个非常复杂的生物学过程，器官中细胞功能的逐渐衰退导致个体最终走向死亡。生物体的衰老由一连串生理的和细胞内部的变化导致的，细胞老化涉及许多复杂机制，包括氧化应激活性氧(ROS)的氧化损伤、DNA突变、蛋白质损伤、端粒功能障碍等。端粒缩短和功能异常导致细胞周期的停滞甚至细胞死亡，机体发生衰老时端粒缩短限制了成体干细胞继续发挥补偿和修复功能。能否从老龄卵子或端粒酶失活的胚胎中高效地分离多能性胚胎干细胞(ES细胞)至今尚未明确。ES细胞是一种独特的细胞，在特定的培养条件下具有无限增殖和自我更新能力，而这些"永葆青春"的ES细胞如何逃脱衰老的命运并保持自身多能性仍是未解之谜。本研究将利用ES细胞作为模型，探索衰老卵子、端粒酶活性缺失和端粒缩短对小鼠ES细胞多能性的影响。 卵子质量随着女性年龄增长而下降，是影响生殖能力的主要因素。卵子中母系遗传物质衰老影响卵子的基因表达以及着床后的胚胎发育。迄今为止，大多数用于研究的ES细胞系来源于年轻的雌性小鼠，能否从生育年龄较大的雌性个体排出的成熟卵子有效地获得多能性ES细胞仍有待研究证实。我们通过人工激活小鼠卵子建立具有多潜能的孤雌胚胎干细胞系(pES)，从而避免精子受精影响对母系物质衰老的研究。结果显示，10-12月龄的C57小鼠产生卵子的数量较年轻的小鼠少，这些卵子表达高水平ROS。年轻小鼠和老龄小鼠来源的孤雌胚胎着床前发育率没有差异，但通过荧光染色检查发现老龄小鼠的孤雌囊胚中内细胞团数(ICM)更少，凋亡细胞数上升，基因组DNA损伤增加，存在显著性差异；但是年轻小鼠和老龄小鼠的囊胚细胞端粒长度并无差别，而两者产生pES细胞系的效率相似。来源于老龄小鼠卵子的pES细胞系在最初两代中产生较少ES样克隆，但在此后的传代过程中克隆数量迅速增长。值得注意的是，与其来源的孤雌囊胚相比，老龄小鼠pES细胞的DNA损伤减少，且与年轻小鼠的pES细胞的DNA损伤情况相似。此外，年轻小鼠和老龄小鼠pES细胞在端粒长度，多能性分子标志的表达如Oct4、Nanog、SSEA1和碱性磷酸酶(AP)，畸胎瘤形成等方面没有差别，嵌合体产生率均较高(约70％)而且每个组织均有ES细胞的贡献。这些结果表明从老龄雌性的卵子能有效分离多能性ES细胞，通过分离和体外培养的过程可以筛选DNA完整和端粒正常的ES细胞系。 我们应用端粒酶活性失活的小鼠模型研究ES细胞分离过程中端粒酶失活和端粒缩短是否影响ES细胞的分离效率和ES细胞的多能性。结果发现，ES细胞系的分离效率在WT，G3以及G4 Terc—/—胚胎中没有差异，KSR ES培养基培养后大约60％的囊胚能分离出ES细胞系，所有的ES细胞系表达多能性分子标志Oct4，Nanog，SSEA1和AP。四倍体胚胎补偿法是检测ES细胞多能性的传统方法，此方法需要融合2-细胞胚胎，且只能用于某些具有杂交背景的早代ES细胞系。我们发现了一种更为简便和高效的方法来检测ES细胞的多能性，该方法通过Piezo注射仪将ES细胞注射入4-或8-细胞胚胎，这些胚胎体内发育形成F0具有完全生殖系转移的ES细胞小鼠或高度嵌合的小鼠，结果显示这种方法产生成活转基因小鼠的效率比四倍体囊胚补偿法高。无论杂合或WT ES细胞系均能产生完全生殖系转移的ES细胞来源的F0小鼠，但是通过这种方法未能获得来源于端粒酶失活小鼠ES细胞的F0小鼠。G1 ES细胞系嵌合体形成率较高(64％)，而G3和G4 ES细胞系的嵌合体形成率效率较低(分别为6％和9％)，都没有生殖系转移发生，结果显示端粒酶失活或端粒缩短以及功能异常降低ES细胞在体内的发育和分化能力。 我们的研究结果表明从老龄卵子和端粒酶活性缺失的胚胎中可高效的分离获得ES细胞，老龄卵子不影响分离pES的多能性，但端粒酶失活及端粒缩短显著降低响ES细胞在体内的分化能力。