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第一部分:PRSS3-SPINKs-KLK5通路在肺腺癌增殖与转移过程中的作用及机制探讨目的:通过临床、细胞生物学及生物信息学等相关研究方法探索PRSS3基因在肺腺癌增殖与侵袭转移过程中的作用及机制。方法:我们采用生物信息学方法采集分析了多个基因芯片数据库中肺腺癌PRSS3的表达水平,并分析了其与预后的关系。通过慢病毒shRNA感染技术敲低了肺腺癌细胞A549、HCC827及PC9中PRSS3基因的表达,并观察对其增殖、侵袭迁移能力的影响;为明确PRSS3作用的下游信号通路,我们在PRSS3敲低的PC9细胞中收集无血清培养液,浓缩后Western Blot分析了浓缩培养液中SPINKs、KLK5及其下游蛋白的表达情况,并通过免疫共沉淀(Co-IP)分析在培养液中是否存在SPINKs与KLK5的结合。最后我们设计小鼠动物模型验证PRSS3在肺腺癌发生发展中的作用,并探究Mesotrypsin(PRSS3的编码蛋白)抑制剂对肺腺癌PC9细胞系增殖、迁移的影响。结果:Oncomine数据库综合分析结果显示PRSS3的表达水平在肺腺癌中较正常肺肺组织中更高;同时K-Mplotter数据库分析发现PRSS3高表达的肺腺癌病例预后较差,差异有统计学意义。细胞实验证实PRSS3敲低可导致肺腺癌细胞系HCC827及PC9增殖、侵袭迁移能力减弱,A549侵袭迁移能力下降。我们在PRSS3敲低的PC9细胞中收集无血清培养液,Western Blot分析了浓缩培养液中SPINK5、KLK5及其下游蛋白的表达情况,结果发现全长的SPINK5含量增高、KLK5活性降低,下游VTN、Collagenl、IGFBP3等效应分子含量增高,并通过免疫共沉淀(Co-IP)确认了 SPINK5与KLK5的直接作用。小鼠原位注射成瘤模型表明PRSS3敲低可抑制小鼠体内PC9细胞的成瘤及增殖。Mesotrypsin的抑制剂可明显抑制肺腺癌PC9细胞系的增殖、侵袭迁移。结论:通过上述临床、细胞生物学和生物信息学的研究证实,PRSS3可能通过促进肺腺癌的增殖、转移,进而影响患者预后,PRSS3-SPINKs-KLK5通路可调控肺腺癌PC9细胞的增殖、转移,PRSS3有望成为新的肺腺癌靶向治疗靶点。第二部分:PRSS3在肺鳞癌增殖与转移过程中作用的初步探索目的:第一部分研究中发现了 PRSS3-SPINKs-KLK5通路在肺腺癌增殖、转移中扮演重要角色。PRSS3促进了肺腺癌的增殖、转移,而本部分研究旨在探索PRSS3在肺鳞癌增殖、转移中扮演的角色及作用机制。方法:我们选取PRSS3高表达的H520进行进一步的研究,通过shRNA慢病毒感染技术敲低了 H520细胞系中PRSS3基因的表达,并观察对H520细胞增殖、侵袭迁移能力的影响;WB检测KLK5或PRSS3敲低后SNAIL1、AKT/p-AKT等分子的表达,以明确PRSS3影响H520细胞增殖、侵袭迁移能力的信号通路。结果:PRSS3敲低后可导致肺鳞癌细胞系H520增殖、侵袭迁移能力减弱。KLK5或PRSS3敲低后磷酸化AKT水平降低,提示AKT通路下调,细胞增殖能力减弱;SNAIL1降低,提示EMT水平下降,细胞侵袭迁移能力下降。结论:H520细胞实验表明PRSS3敲低可以抑制AKT信号通路,并抑制EMT,与KLK5敲低的结果相似,PRSS3可能通过调控KLK5发挥作用,PRSS3在肺鳞癌中的作用及机制有待进一步深入研究探索证实。