论文部分内容阅读
糖鞘脂是一类含有亲脂性神经酰胺尾部和亲水性寡糖基头部、广泛分布于细胞膜表面的糖脂。GM1是一种含有唾液酸的糖鞘脂,具有维持细胞膜稳态,调控细胞增殖、粘附、识别和信号传导等重要作用,另外还参与了癌症的发生和发展。然而,GM1对乳腺上皮细胞增殖和迁移的调控作用和相关分子机制仍不清楚。因此,研究GM1对乳腺上皮细胞增殖和迁移的影响,有助于深入了解GM1在乳腺癌发生发展中的作用,为乳腺癌的治疗提供实验基础。本课题以乳腺上皮细胞为研究对象,分析外源添加和内源改变GM1对细胞增殖和迁移的影响,提出GM1调控乳腺上皮细胞增殖和迁移的可能机制。主要研究结果如下:(1)外源添加GM1能够抑制乳腺上皮细胞在高密度时的细胞增殖。通过EdU细胞增殖、Western blot和流式细胞术等实验证实在高密度时,乳腺上皮细胞MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、BT-549和SK-BR-3存在接触抑制生长现象。流式细胞术和薄层层析检测发现细胞在高密度时GM1表达显著升高。外源添加GM1能抑制高密度细胞增殖,抑制EGFR信号通路激活,但对常规密度细胞增殖没有影响。(2)内源过表达GM1能够抑制乳腺上皮细胞在高密度时的细胞增殖。通过慢病毒转染技术构建GM1敲低和过表达稳定转染细胞株,发现过表达GM1能够抑制高密度细胞增殖,抑制EGFR信号通路激活,而敲低GM1则表现出相反的结果。此外,过表达或敲低GM1对常规密度细胞增殖能力和EGFR活性没有显著影响。(3)GM1能够通过促进EGFR在小窝区的分布来抑制EGFR的激活。利用膜组分分离、免疫共沉淀和OptiPrep密度梯度离心等实验检测发现,相较于常规密度细胞,在高密度细胞中,EGFR在糖鞘脂富集区(GEM)的分布减少,在小窝区的分布增加。免疫荧光染色实验表明,细胞在高密度时,外源添加GM1能够促进EGFR在小窝区分布,抑制EGFR在糖鞘脂富集区分布。综合以上结果,本文提出GM1调控乳腺上皮细胞增殖的可能机制:即GM1通过促进EGFR从糖鞘脂富集区到小窝区的分布来抑制EGFR的激活,进而抑制细胞增殖。(4)过表达GM1能够促进乳腺上皮细胞迁移。通过检测上皮间质转化(EMT)相关蛋白标志物表达,发现过表达GM1能使MCF-10A细胞发生类似EMT的变化。细胞悬滴聚集和细胞贴壁实验证实过表达GM1后细胞之间的粘附能力减弱、细胞与胞外基质之间的粘附增强。Transwell细胞迁移实验表明过表达GM1能促进细胞迁移。TGF-β处理细胞检测发现过表达GM1能够促进TGF-β诱导细胞发生EMT。总结以上,内源性过表达GM1能够使乳腺上皮细胞提高迁移能力及发生类似EMT的变化。(5)外泌体中GM1含量增加能增强癌细胞来源外泌体促进乳腺上皮细胞移的作用。通过Western blot、transwell细胞迁移等实验确认MDA-MB-231细胞的条件培养基能够使MCF-10A和MCF-7细胞提高迁移能力及发生其他EMT相关变化,而在MDAMB-231细胞中过表达GM1能够增强条件培养基的这种作用。利用差速离心法从条件培养基中提取外泌体,并通过外泌体标志物检测、粒径检测、透射电镜等实验确认提取的外泌体符合标准。通过免疫电镜、密度梯度离心、流式细胞术等实验证实外泌体存在GM1的表达,并且供体细胞过表达GM1能够提高外泌体中GM1含量。外泌体处理MCF-10A细胞证实内源性过表达GM1能增强癌细胞来源的外泌体的如下作用,即促进乳腺上皮细胞迁移和诱导乳腺上皮细胞发生类似EMT的相关变化。