拉曼光谱分析技术在黄酒质量监控中的应用研究

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黄酒是我国最具历史底蕴的酒种,享有“国酒”的美誉。近年来,我国黄酒产业蓬勃发展,而其检测技术依然相对落后,主要还是依靠操作复杂、耗时耗力的常规理化分析方法。开发一系列适用于黄酒产业安全生产的高通量快速检测技术具有十分重要的现实意义。本课题以黄酒为研究对象,采用拉曼光谱分析技术对黄酒的关键发酵参数、品质指标、氨基甲酸乙酯、组胺及致病菌进行了分析研究,并建立了相应的快速检测方法,这不仅可以为黄酒的质量检测提供新手段、新方法,还将有利于降低检测成本、保证黄酒品质、推动黄酒检测技术的规范化与科学化。采用拉曼光谱、傅里叶近红外光谱(FT-NIR)及傅里叶红外光谱(FTIR)同时对黄酒的发酵过程进行监控,发现拉曼光谱在451 cm-1、520 cm-1、1124 cm-1及879 cm-1处、FT-NIR光谱在5590 cm-1及4338 cm-1处、FTIR光谱在1090 cm-1、1042 cm-1及2995cm-1处的谱峰均随发酵时间的延长呈现规律性的变化,表明三种光谱均含有与黄酒发酵进程密切相关的特征信息。基于三种不同种类光谱数据建立了偏最小二乘判别分析(DPLS)模型,结果显示,三种光谱中FTIR对不同发酵阶段的区分效果最差,拉曼光谱与FTIR的分类结果相近。基于拉曼光谱、FT-NIR和FTIR数据对三个关键发酵参数(乙醇、总糖和总酸)分别建立偏最小二乘(PLS)模型,结果显示三种光谱中,拉曼光谱明显比另外两种更适用于黄酒发酵过程的监控。最终基于拉曼光谱对乙醇、总糖和总酸含量建立的校正模型的R2分别为0.95、0.94和0.93,完全符合定量分析的要求。基于拉曼光谱和化学计量学对成品黄酒的常规品质指标(乙醇、总糖、总酸和pH)和抗氧化指标(DPPH、ABTS、FRAP和总酚)进行了定性和定量分析研究。主成分分析(PCA)得分图显示,基于拉曼光谱,不同品牌和不同产地的黄酒样品区分度显著,不同种类间的样本不发生重叠,表明拉曼光谱具有良好的分类能力。基于拉曼光谱建立的回归模型的分析结果显示,经典PLS模型对乙醇、pH和总酚具有优良的预测性能。而对于总糖、总酸、DPPH、ABTS和FRAP等指标的定量分析,则采用联合区间偏最小二乘(SiPLS)算法优选出拉曼光谱中相对贡献较大的特征变量,基于波段优选过程选出的光谱变量建立了SiPLS模型,结果显示该模型对总糖、总酸、ABTS和FRAP的预测性能得以大幅提升,R2分别达到0.90、0.93、0.90和0.92,可以用于这四个指标的定量分析。但对于DPPH,即使经过波长优选,其SiPLS模型的性能仍不理想,预测集的R2仍然小于0.90。FTIR和拉曼光谱可以反映黄酒不同维度的信息,故利用两者间的互补性,可以通过适当的数据融合技术提取两者的特征信息并结合,以此建立新的回归模型。在这些新的模型中,由于黄酒组分复杂,非线性回归模型比线性回归模型更适用于黄酒DPPH自由基清除能力的快速测定,最终我们选择SiSVMC模型用于对DPPH进行定量分析,其预测集R2达到0.93,远优于未采用数据融合的模型。此外,相关性分析表明黄酒中的总酚含量与其各抗氧化能力指标均显著正相关,HPLC结果显示黄酒中的主要酚类成分为儿茶酸、原儿茶酸和丁香酸。将分子印迹技术、固相萃取技术和表面增强拉曼光谱(SERS)技术相结合,建立了一种“两步法”快速测定黄酒中氨基甲酸乙酯含量的新方法。以硅胶为载体,甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,偶氮二异丁腈为引发剂,成功地制备了大小均一(200 nm)、热稳定性良好的氨基甲酸乙酯的分子印迹纳米颗粒(MIPs)。吸附试验表明合成的分子印迹聚合物中含有大量与氨基甲酸乙酯分子相匹配的特异性结合位点,且该聚合物可在短时间内实现对样品中氨基甲酸乙酯分子的快速提取。重复使用试验表明MIPs被循环使用10次后,其吸附能力仍可达初始吸附能力的87.20%,表现出良好的重复使用性能。以本实验合成的MIPs为吸附剂,先后对固相萃取试验中MIPs的用量、上样流速、淋洗溶剂和洗脱溶剂等参数进行了优化。最佳试验条件下,使用该方法对实际黄酒样品进行加标回收试验,结果显示氨基甲酸乙酯的回收率在87%-102%之间;对氨基甲酸乙酯建立的校正模型的R2和RPD分别在0.90和3.0以上,表明所建立的“两步法”适用于黄酒中氨基甲酸乙酯含量的测定。利用高温分解法合成了NaYF4:Yb,Er上转换发光纳米材料(UCNPs),进一步采用聚丙烯酸(PAA)对其表面进行修饰,为其在水相溶液中的应用提供了条件。以经过PAA修饰的UCNPs为内核,在其表面合成组胺的分子印迹聚合物,在聚合过程中引入银离子,最终将上转换发光技术、分子印迹技术与SERS技术相结合,合成了一种具有荧光-SERS双响应功能的材料,即UCNPs@MIPs-AgNPs。TEM、XRD及FTIR的表征结果显示,合成的UCNPs@MIPs-AgNPs纳米复合物颗粒均匀、分散性良好。UCNPs@MIPs-AgNPs的静态吸附、动态吸附和选择性吸附试验则展现了其优异的选择性吸附能力。采用UCNPs@MIPs-AgNPs建立了荧光和SERS两种不同模式下测定组胺含量的标准曲线,两种回归曲线的R2均在0.98以上,表现出良好的拟合效果。该方法的加标回收率在93.30%-108.30%之间,且其检测结果与HPLC测得的参考值之间无显著差异,表明该方法可以用于黄酒中组胺含量的精确测定。引入磁聚焦的概念,采用基于SERS的侧向层析法(LFICA)测定黄酒中的鼠伤寒沙门氏菌的含量。采用TEM、VSM、Zeta电位、XRD、TGA、UV-Vis及FTIR等手段对金磁纳米颗粒(Fe3O4@Au)进行了系统地表征,结果表明成功合成了大小均匀、表面光滑、具有良好的磁响应性和热稳定性的Fe3O4@Au壳核型纳米颗粒。优化了LFICA的几个关键条件参数,确定了其最佳实验条件:硝基纤维膜类型:90-CNPH-N-SS40;固定在硝基纤维膜上的抗体量:0.3μg;信号探针添加量:0.5μL。采用基于酶辅助颜色增强的LFICA(EACA-LFICA)和基于SERS增强的LFICA(SERS-LFICA)两种不同的方法对不同浓度的沙门氏菌进行测定,并对比了采用磁聚焦策略与不采用该策略所得结果之间的差别,结果表明磁聚焦策略对于提高LFICA的灵敏度有显著的效果。通过对比两种方法,最终选择SERS-LFICA作为检测方法。建立的磁聚焦SERS-LFICA法在沙门氏菌浓度为25-5000 CFU/mL的范围内展现出良好的线性关系,回归曲线为y=5722.71-7556.88,R2=0.9938,检测限和定量限分别为15 CFU/mL和25 CFU/mL。将该方法用于黄酒实际样品的检测,结果显示回收率在96.00%-103.33%之间,表明了该方法的准确性和可靠性。
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