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马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata(Say)是马铃薯上的重要害虫,也是我国重大检疫对象。目前马铃薯甲虫的防治手段过于依赖化学药剂,导致马铃薯甲虫几乎对所有已注册化学农药都产生了不同程度的抗性。目前急需研究新的化学防治替代技术。RNA干扰专一性强,对环境友好,是一种潜在的害虫防治新技术。而目前RNA干扰仍不能应用到田间防控,其最主要的原因在于,ds RNA稳定性较低,昆虫中RNA干扰的信号转导方式不甚明了,还有昆虫中的RNA干扰的作用机制报导相对较少。本研究对马铃薯甲虫的6个RNA干扰核心元件基因进行了克隆,多重序列比对和系统发育分析,通过qPCR技术对这6个基因的时空表达进行了分析,通过RNA干扰技术对这6个基因的功能进行了阐述。主要获得了以下的结果:1、利用马铃薯甲虫转录组和基因组数据,通过相似性搜索软件blast搜索获得了马铃薯甲虫的两个Sid-1,两个Dicer-2和Ago-2 c DNA序列。通过提取马铃薯甲虫的总RNA,反转录和PCR等一系列分子生物学技术,克隆获得了2个Sid-1和Dicer-2的全长序列,2个Ago-2的部分序列。通过对马铃薯甲虫,黑腹果蝇和赤拟谷盗等Sid-1的蛋白质序列的多重序列比对,发现马铃薯甲虫的2个Sid-1具有昆虫Sid-1的经典结构域,包括一段信号肽,4段保守基序和11个跨膜域,表明马铃薯甲虫的这2个Sid-1应具有昆虫Sid-1的功能。通过系统发育聚类分析,2个马铃薯甲虫的Sid-1分别与赤拟谷盗的TcSid-1a和TcSid-1c相似性最高,由此将马铃薯甲虫的这2个Sid-1分别命名为LdSid-1a和LdSid-1c。2个Dicer-2和2个Ago-2在前人的研究中已经进行了序列分析和命名。2、组织表达和龄期表达分析发现:(1)参与RNA干扰过程的6个基因(除LdAgo2b)在龄期表达具有相似的表达情况,即随幼虫的生长发育,表达量逐渐升高,LdAgo2b则是在4L刚蜕皮和72h大小的幼虫中具有较高的表达,而在其它阶段都仅为痕量表达,表明这些元件基因在马铃薯甲虫的高龄幼虫阶段参与了重要的生理功能;(2)对马铃薯甲虫的4L老熟幼虫的各个组织和成虫的生殖腺中测定了组织表达情况,结果表明这6个元件基因(除LdAgo2b)在各个组织中均有表达,且在肠道中表达量均较高,因此选用喂食的方法进行RNA干扰实验。3、通过喂食dsRNA的方法,对RNA干扰核心元件基因LdDicer2a,LdDicer2b,LdAgo2a,LdAgo2b,LdSid-1a和LdSid-1c的基因功能进行了研究。首先,对三龄幼虫喂食(1)LdSid-1a(2)LdSid-1c(3)LdDicer2a(4)LdDicer2b(5)LdAgo2a(6)LdAgo2b(7)LdSid-1a和LdSid-1c(8)LdDicer2a和LdDicer2b(9)LdAgo2a和LdAgo2b的dsRNA,分别观察这些处理组的幼虫取食量,行动力,化蛹率和羽化率。发现无论是单独干扰还是混合干扰元件基因均不会对马铃薯甲虫的幼虫产生致死效应,也没有观察到幼虫化蛹和羽化后翅的畸形表型。为了进一步研究这些基因在RNA干扰过程中的作用,选定了致死基因ds ATPase E作为研究工具。首先测定了dsATPase E对马铃薯甲虫4L幼虫的LC50为表达菌液稀释的1/883。通过九组预处理元件基因的dsRNA,再于处理后3d喂食稀释10倍,稀释100倍和稀释1000倍的dsATPaseE菌液,发现在LdAgo2和LdDicer2的处理组中,单独干扰的处理组能部分缓解ds ATPaseE的致死效应,混合处理组能基本恢复dsATPase E的致死效应。而在(1)dsSid-1a(2)dsSid-1c(3)dsSid-1a和dsSid-1c的处理组中,无论dsATPase E稀释10倍,稀释100倍还是稀释1000倍,虽然通过qPCR成功检测到这些基因已经成功通过RNA干扰降低了表达,但是这些处理组的表型结果和对ATPase E的表达量检测结果均与dsegfp的处理结果较为相似。说明LdSid-1影响RNA干扰的方式与LdDicer2和LdAgo2不相类似。