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目的:通过体外培养大鼠肾小管上皮细胞,用高糖和TGF-β1分别诱导,再以沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)激动剂(白藜芦醇,RSV),SIRT1抑制剂(EX527),三七皂苷(PNS)分别干预,观察其上皮细胞-间充质转化(Epithelialmesenchymal transition,EMT)的发生及相关指标的变化,探讨三七皂苷对肾小管上皮细胞EMT发生的影响,及基于SIRT1/TGF-β1/Smad信号通路探讨其作用机制,为糖尿病肾脏疾病提供新的治疗方法和实验依据。方法:1、三七皂苷对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响在DMEM培养基中,用10%胎牛血清培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)。将细胞分为空白组(5.5mmol·L-1葡萄糖)、高糖组(30mmol·L-1葡萄糖)、RSV组(30mmol·L-1葡萄糖+50mg·L-1 RSV)、PNS组(30mmol·L-1葡萄糖+100 mg·L-1 PNS)、EX527组(30mmol·L-1葡萄糖+10μmol·L-1 EX527)、EX527+PNS组(30mmol·L-1葡萄糖+10μmol·L-1 EX527,1小时后加100 mg·L-1 PNS)。药物干预48h后收集细胞;采用免疫组化技术检测α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙黏着蛋白(E-cadherin)的表达;Real-time PCR检测α-SMA、E-cadherin、SIRT1、TGF-β1、Smad3、Smad4的m RNA表达,Western blot检测α-SMA、E-cadherin、SIRT1、TGF-β1蛋白表达。免疫共沉淀检测SIRT1与Smad3的结合水平。2、三七皂苷对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响复苏细胞,在DMEM培养基中,用10%胎牛血清培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),分为空白组(5.5mmol·L-1葡萄糖),TGF-β1组(5μg·L-1 TGF-β1),RSV组(5μg·m L-1 TGF-β1+50 mg·L-1 RSV),EX527组(5μg·L-1 TGF-β1+10μmol·L-1 EX527),PNS组(5μg·L-1 TGF-β1+100mg·L-1 PNS),EX527+PNS组(5μg·L-1 TGF-β1+10μmol·L-1 EX527,1h后加100 mg·L-1PNS),48 h后收集细胞;采用Real-time PCR法检测α-SMA、E-cadherin、SIRT1、TGF-β1、Smad3、Smad4的m RNA表达;Western blot检测SIRT1、α-SMA、E-cadherin、TGF-β1等蛋白表达。结果:1、三七皂苷对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响(1)免疫组化结果显示,空白组NRK-52E细胞膜上E-cadherin表达明显,高糖干预后则表达减弱,而胞质内α-SMA的表达明显增多。(2)荧光定量PCR结果显示,与空白组比较,高糖组中的Ecadherin表达减少(P<0.01),α-SMA表达增多(P<0.05)。与高糖组比,RSV组和PNS组的E-cadherin和SIRT1表达增加(P<0.01),TGF-β1、Smad3、Smad4和α-SMA表达减少(P<0.05);EX527+PNS组各项指标表达同高糖组。(3)Western-blot结果显示,与空白组比较,高糖组中E-cadherin、SIRT1蛋白表达减少,α-SMA、TGF-β1蛋白表达增加。与高糖组比较,PNS组和RSV组内E-cadherin和SIRT1蛋白表达增加(P<0.01),TGF-β1和α-SMA蛋白表达减少(P<0.01)。(4)免疫共沉淀结果显示,Smad3和SIRT1之间存在相互作用,SIRT1可以直接使Smad3去乙酰化。2、三七皂苷对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响(1)荧光定量PCR结果显示,与空白组比较,TGF-β1组E-cadherin m RNA表达明显减少(P<0.01),α-SMA m RNA表达增多(P<0.05)。与TGF-β1组比较,PNS组和RSV组E-cadherin m RNA表达均显著增加(P<0.01),α-SMA表达显著减少(P<0.01),EMT发生被抑制。同时,SIRT1表达显著增加(P<0.01),TGF-β1、Smad3、Smad4表达显著降低(P<0.01)。在SIRT1阻断剂EX527的干预下,PNS不能发挥明显抑制作用。(2)Western-blot结果显示,与空白组比较,TGF-β1组中α-SMA蛋白表达增多(P<0.01),E-cadherin蛋白表达减少(P<0.01),SIRT1表达降低(P<0.01),TGF-β1表达上升(P<0.01)。与TGF-β1组比较,PNS组和RSV组E-cadherin和SIRT1蛋白表达均显著增加(P<0.01),α-SMA和TGF-β1表达显著减少(P<0.01),EX527+PNS组蛋白表达同TGF-β1组。结论:1、高糖和TGF-β1诱导后的大鼠肾小管上皮细胞α-SMA表达明显,E-cadherin表达减少,提示细胞发生EMT。2、使用白藜芦醇和三七皂苷进行干预,α-SMA表达降低,E-cadherin表达增加,EMT被抑制,提示三七皂苷和白藜芦醇对高糖和TGF-β1诱导后的肾小管上皮细胞有保护作用。3、使用EX527抑制SIRT1的活性后,再加入三七皂苷不能逆转高糖和TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT发生,提示三七皂苷可能通过激活SIRT1,抑制TGF-β1/Smad通路,减轻EMT的发生,进而对肾小管上皮细胞起到保护作用。