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目的:本研究旨在基于网络药理学筛选柚皮苷防治牙周炎的靶点和通路,再通过实验性大鼠牙周炎和成骨前体细胞分别在体内和体外探讨柚皮苷促进牙槽骨成骨的疗效及机制,为进一步开发含柚皮苷的牙周防治药物提供理论和实验依据,还为牙周炎的防治提供新思路和方法。方法:1.SWISSADME、ADMETLAB 2.0和PROTOX Ⅱ数据库预测柚皮苷的吸收、分布、代谢、排泄和毒性的参数;TCMSP和Pub Chem获取柚皮苷结构和作用靶点,Swiss Target Prediction和Pharm Mapper根据结构预测柚皮苷作用靶点;DrugBank、GeneCards、OMIM、NCBI-Gene和DisGeNET数据库获取牙周炎的疾病靶点;Venn分析获得柚皮苷防治牙周炎的交集靶点;STRING数据库构建交集靶点的PPI网络,并根据CytoHubba和CytoNCA筛选出核心靶点;GO及KEGG富集分析潜在生物学功能和信号通路;分子对接评估柚皮苷与核心靶点的结合能力。2.选取42只SD大鼠随机分为7组(n=6):对照组;牙周炎模型组;甘油溶剂组;盐酸米诺环素组;高浓度柚皮苷组(4%);中浓度柚皮苷组(0.4%);低浓度柚皮苷组(0.04%)。除对照组外,在左上颌第一磨牙周围系结扎线诱导大鼠形成牙周炎。从第1-14天每日牙周局部溶剂、盐酸米诺环素和柚皮苷处理,每日记录体重、牙龈出血指数、牙周袋探诊深度和牙齿松动度。干预结束后,将大鼠安乐死,对左上颌行Micro CT分析骨参数;收集血清和第一磨牙周围牙龈分析血清Il6、Ptgs2和Mmp9水平及牙龈组织中Opg、Runx2、Rankl、Beclin1、Lc3、Akt1、Ptgs2、Mmp9和Il1β的mRNA表达水平。基于大鼠颌骨组织切片分析炎症、成骨和破骨能力及Ptgs2、Il1β、Il6、Tnf-α、Rankl、Opg、Ocn、Bmp2、Bcl2和Bax在组织中表达水平。3.CCK8检测不同浓度柚皮苷对MC3T3-E1细胞增殖的影响并确定后续实验所需药物浓度。流式与荧光染色观察柚皮苷对细胞周期与凋亡的影响。(1)成骨能力:ALP染色及活性与茜素红染色观察柚皮苷促进成骨分化及矿化能力;免疫荧光观察Ocn表达情况,RT-qPCR和Western blot检测Ocn、Runx2、Alp、Col-1和Osterix的mRNA及蛋白表达水平。(2)自噬情况:AO、Lyso-Tracker Red染色及透射电镜观察细胞自噬情况;免疫荧光观察LC3B的表达情况,RT-qPCR和Western blot检测Lc3、Beclin1、SQSTM1/p62和Atg5的mRNA及蛋白表达水平。4.自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)处理后,流式细胞分型观察细胞周期与凋亡的影响。成骨及自噬水平检测同第三部分。Western blot检测通路蛋白Akt与mTOR的表达情况,探讨Akt/mTOR通路在柚皮苷介导自噬促进成骨中的作用。结果:1.柚皮苷作用靶点经筛选共得到防治牙周炎的149个潜在靶点。PPI网络分析筛选出AKT1、IL1B、ALB、IL6、CASP3、MMP9、CCL2、PTGS2、CXCL8、TLR4、EGF、TNF和IGF1共13个核心靶点。GO和KEGG分析表明,柚皮苷防治牙周炎主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控及负调控、细胞增殖的正调控、细胞凋亡过程的负调控、信号转导和炎症反应等生物学过程;与PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、破骨细胞分化和自噬等信号通路有关。分子对接显示柚皮苷与上述13个核心靶点具有良好的结合活性。2.与牙周炎模型组相比,应用柚皮苷后显著降低CEJ-ABC距离、改善牙龈出血指数、降低牙周袋探诊深度和牙齿松动度(P<0.05)。X线片和Micro CT结果显示牙周炎模型组的牙槽骨丢失显著增加,柚皮苷治疗后能显著降低牙槽骨的丢失(P<0.05)。组织学分析中柚皮苷显著降低牙周组织炎症水平(P<0.05)、促进新骨的形成、缓解胶原纤维破坏和减少破骨细胞数量(P<0.05)。柚皮苷治疗显著下调Ptgs2、Tnf-α、Il1β和Il6在组织中的表达及Il1β、Ptgs2和Mmp9的mRNA水平,显著降低局部炎症反应;显著上调Opg、Ocn和Bmp2在组织中的表达及Opg和Runx2的mRNA水平,促进成骨作用;显著下调Rankl和Bax在组织中的表达及Rankl的mRNA水平,抑制破骨及细胞凋亡。血清中Ptgs2、Il6和Mmp9浓度的降低也证实上述结果。3.CCK8结果显示100μM-1n M柚皮苷显著促进MC3T3-E1细胞增殖的能力(P<0.05),其中10、1和0.1μM柚皮苷显著促进细胞增殖能力(P<0.001)。柚皮苷还显示出一定的抑制凋亡能力,但差异无统计学意义。1μM和100n M柚皮苷能显著促进ALP的表达(P<0.001),同时还能促进成骨分化及矿化(P<0.001);其中,1μM柚皮苷促进成骨分化最佳,显著上调Ocn、Runx2、Alp、Col-1和Osterix的mRNA及蛋白表达水平。柚皮苷还能诱导自噬,增加自噬相关因子Beclin1、Atg5的表达以及从Lc3 I到Lc3 Ⅱ的转化。4.经3MA预处理后,细胞凋亡显著增加、Bax mRNA显著升高、Bcl2 mRNA显著降低(P<0.05),但柚皮苷与3MA联合应用后,上述现象得到一定程度的逆转。用3MA处理后,成骨细胞表现出ALP染色及活性、茜素红染色、成骨分化和成骨标志基因的显著抑制(P<0.001)。此外,与柚皮苷处理的细胞相比,柚皮苷+3MA组的ALP染色及活性、茜素红染色和成骨分化作用降低。证实了柚皮苷介导的自噬能促进成骨分化、矿化和成骨相关基因的表达,可能是牙周炎的潜在治疗靶点。经柚皮苷处理后总Akt表达量无明显改变,但p-Akt显著降低(P<0.001),下游调控蛋白总mTOR表达量无明显变化,但p-mTOR表达量较对照组显著降低(P<0.001);经3MA处理后细胞Akt和mTOR磷酸化蛋白一定程度恢复,此外Western blot结果也显示自噬蛋白Lc3 Ⅱ等与成骨蛋白Ocn等表达量较对照组显著减少,细胞自噬活性降低且此时柚皮苷促进成骨细胞分化的作用显著下降。因此,Akt/mTOR通路参与柚皮苷介导自噬的促成骨分化的作用。结论:1.整合生物信息学、网络药理学和分子对接初步揭示了柚皮苷防治牙周炎的潜在靶点和分子机制,为后续的动物和细胞实验提供参考。2.局部应用柚皮苷治疗大鼠实验性牙周炎能促进牙槽骨形成、减少牙槽骨丢失、降低炎症和促进自噬作用,显示出其防治牙周炎的潜力。3.柚皮苷能促进成骨细胞分化、矿化和自噬。4.柚皮苷通过Akt/mTOR通路介导的成骨细胞自噬促进成骨分化。综上所述,本研究证实了柚皮苷通过Akt/mTOR通路介导的自噬能促进牙槽骨成骨作用,在牙周炎的防治中发挥重要作用,是潜在的牙周防治药物,也为牙周炎的临床诊疗提供新思路。