研究背景:继发性甲状旁腺功能亢进症（Secondary hyperparathyroidism,SHPT）是慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）常见远期并发症。SHPT可导致多个脏器功能损伤,其中最主要的临床表现是患者骨代谢异常后伴发肾性骨营养不良,临床又常称之为肾性骨病,患者可表现为骨折、骨骼及肌肉疼痛以及骨组织缺血性坏死,更严重者可出现退缩人综合征（身高缩短）及Sagliker综合征（狮面相、弓形腿、杵状指）,严重影响CKD患者生活质量,这也是近些年临床医生十分关注的一个重点问题。骨活检作为诊断肾性骨营养不良的金标准,因其具有创伤性,在临床诊疗中很难被CKD患者所接受。因此,寻找一种无创、高灵敏度且可以快速反映患者的骨代谢水平的标志物成为一个亟待解决的问题。而在分子生物学水平上,探究具有代表性的生物标志物在骨代谢异常中的调控机制更是我们需要深入研究的方向。针对这一问题,我们从临床数据分析出发,发现当SHPT患者的骨代谢异常出现严重的临床并发症时,常需要行甲状旁腺切除手术（Parathyroidectomy,PTX）来根治,但是术后患者为修复这种骨代谢损伤,常会出现低钙血症/骨饥饿综合征。大量临床研究表明,患者术前骨代谢异常水平与术后出现骨饥饿程度密切相关,即术前骨代谢异常程度越严重,骨痛、骨骼畸形越明显时术后出现的低钙血症/骨饥饿程度越严重,因此我们通过Meta分析及R语言分析建立Nomogram预测模型试图找到临床相关的实验室检查指标用以预测术后骨饥饿的水平,进而揭示CKD患者的骨代谢异常的活跃程度。通过临床数据分析结果得出:碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）及甲状旁腺素（Parathyroid hormone,PTH）水平是评估CKD-SHPT患者发生严重骨代谢的实验室生物学标志物,且大量文献研究表明PTH在骨代谢的调控中起着十分重要的作用,已经有大量临床及基础研究证实小剂量间断性给予PTH可以促进骨形成,但是针对大剂量持续性给予PTH时骨代谢异常的机制研究目前尚不明确,于是我们通过对PTX术前术后患者的血清进行采样,利用蛋白组学探究与PTH诱导骨代谢异常相关的蛋白分子,最终我们发现几丁质酶3样蛋白1（Chitinase 3 like protein 1,CHI3L1）与PTH诱导骨代谢异常关系密切,我们继续通过实验进一步验证其生物学功能特性。CHI3L1是在1993年首次发现的人类软骨分泌型糖蛋白-39,近年来科学研究发现CHI3L1参与多种疾病的发生发展,包括癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、哮喘以及精神分裂症等,其在激活炎症反应、巨噬细胞分化、细胞凋亡以及组织损伤和修复过程中均发挥着重要的生物学作用,但其在骨代谢中的表达水平、功能特征及机制研究目前尚不明确。P38/FOXO1作为一个MAPK家族中重要的信号,叉头框转录因子（Forkhead box protein,FOX）家族是其中非常重要的转录因子,其生物学特性复杂多样,参与多种细胞调控过程,包括细胞代谢、氧化应激、DNA修复、细胞周期阻滞、细胞凋亡和自噬等。已有研究证实FOX在许多疾病（癌症、骨质丢失、心血管疾病、神经组织退化等）进展过程中都发挥着重要调控作用,但其是否参与PTH诱导骨代谢异常调控机制,目前实验研究证据尚不充足。本项研究希望通过对CHI3L1在CKD-SHPT中的生物学功能、表征特性及通过P38/FOXO1信号通路可能存在的调控机制进行深入研究,初步阐明CHI3L1在骨代谢中发挥的生物学作用,可能成为骨代谢活跃程度的重要标志物,也可能会成为治疗肾性骨病的新靶点。研究目的:1、通过临床数据分析,探究可能提示SHPT骨代谢异常程度的实验室生物标志物;2、通过蛋白组学差异性分析及反向PRM（Parallel reaction monitoring,PRM）平行反应监测,探究PTX术前、术后参与骨代谢调控的目标蛋白分子;3、阐明目标蛋白CHI3L1在PTH作用下的表达特性及其诱导细胞凋亡的功能特性;4、阐明目标蛋白CHI3L1通过P38/FOXO1信号通路在CKD骨代谢异常中的作用机制。研究方法:（1）PTH及ALP在CKD-SHPT中骨代谢异常中的表达变化本研究收集2018年1月-2021年8月吉林大学第二医院维持性血液透析患者（合并CKD-SHPT且接受PTX）的临床及生化资料进行回顾性分析。利用单因素/多因素Logistic回归、接收者操作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）等统计学方法分析确定PTX术后低钙血症危险因素的最佳临界值和检验Logistic回归模型的预测效能;建立Nomogram预测模型并绘制列线图,采用Bootstrap法（原始数据重复抽样法）对列线图模型进行内部验证。另外,我们通过检索Cochrane Library、Embase、Pub Med、Web of Science等电子数据库,共纳入了13项研究进行Meta分析探究PTX术后低钙血症危险因素,用以预测PTX术后的低钙血症的发生率以及评估术前骨代谢异常活动水平。（2）PTH介导的CKD-SHPT中骨代谢异常的差异蛋白表达分析收集PTX手术患者术前术后血清样本并进行分组,术前组选取PTH＞4000pg/ml的患者的血清样本作为pre组,术后第1天的患者的血清样本作为Pos＿d1组,为防止术后第1天由于手术干预导致的大量炎症细胞因子释放而出现对骨代谢结果的干扰,又收集了PTX术后第7天的患者血清样本作为Pos＿d7组,将三组患者血清共计22个样本进行蛋白组学差异表达分析,并对分析出来的结果进行反向PRM验证。（3）CHI3L1在SHPT甲状旁腺组织及血液样本中的表达变化利用多种方法检测PTX患者术后切除的甲状旁腺组织中CHI3L1表达水平,同时检测在血液样本中CHI3L1表达水平。（4）CHI3L1在PTH诱导MC3T3-E1中的表达变化培养小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）,对其进行成骨分化诱导,应用茜素红染色、碱性磷酸酶染色、q RT-PCR、Western blot进行成骨活性检测,给予不同浓度、不同给药时间的PTH刺激成骨细胞后应用CCK-8（Cell Counting Kit-8）检测PTH对成骨细胞增殖能力的影响,应用流式细胞术、Tunel染色等方法检测PTH对成骨细胞凋亡的影响,应用q RT-PCR及Western blot检测CHI3L1在PTH刺激后的表达量。（5）CHI3L1在PTH诱导的MC3T3-E1的细胞凋亡中的作用将MC3T3-E1在基因层面上对CHI3L1进行过表达-慢病毒感染及敲除-慢病毒感染,形成稳定的过表达-慢病毒细胞株（OE-CHI3L1）、过表达阴性对照-慢病毒细胞株（OE-CHI3L1-NC）、敲除-慢病毒细胞株（KD-CHI3L1）以及敲除阴性对照-慢病毒细胞株（KD-CHI3L1-NC）,对感染慢病毒细胞株进行硫唑嘌呤抗性筛选、对稳定株进行GFP荧光检测,同时行q RT-PCR及Western blot检测CHI3L1的表达量从而评估慢病毒感染效力。给予大剂量持续的PTH刺激后对骨代谢相关蛋白以及凋亡相关蛋白进行q RT-PCR及Western blot检测,验证CHI3L1在PTH诱导的MC3T3-E1的成骨分化及诱导凋亡过程中发挥的生物学效能。（6）CHI3L1在P38/FOXO1信号通路促进PTH诱导的MC3T3-E1细胞凋亡中的作用应用Western blot检测PTH诱导的MC3T3-E1细胞凋亡中p-P38/P38、FOXO1信号通路蛋白的表达水平,评估P38/FOXO1信号通路在PTH诱导的MC3T3-E1细胞凋亡中的激活情况。用同样方法检测OE-CHI3L1、KD-CHI3L1组经PTH诱导后P38/FOXO1信号通路蛋白的表达水平。应用P38-MAPK抑制剂抑制P38/FOXO1下游的信号通路后,应用Western blot法检测通路相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达量,应用Tunel染色、流式细胞术检测细胞凋亡水平,评估P38-MAPK抑制剂对PTH诱导的细胞凋亡的影响,以及CHI3L1在P38/FOXO1信号通路中的调控机制。研究结果:（1）PTH及ALP在CKD-SHPT中骨代谢异常中的表达变化我们通过对单中心数据进行R语言分析及对多中心的13项研究进行Meta分析,最终得出结论:术前高ALP及高PTH水平是PTX术后低钙血症/骨饥饿发生的独立危险因素。ALP及PTH水平一方面可以作为PTX术后低钙血症的预测因子,另一方面也揭示了患者术前骨代谢异常活跃水平,为进一步探究骨代谢异常的机制研究提供了重要的线索。（2）PTH介导的CKD-SHPT中骨代谢异常的差异蛋白表达分析通过对SHPT患者术前术后血清样本中的蛋白成分进行蛋白组学的差异表达分析,找出154个差异表达的蛋白分子,经过扩大SHPT患者的血清样本量进行PRM验证后我们最终得出30个具有统计学差异的目的蛋白,再通过大量文献检索和ELISA初筛将可能与骨代谢异常调控相关目的蛋白锁定为CHI3L1蛋白。（3）CHI3L1在SHPT甲状旁腺组织及血液样本中高表达通过对PTX手术患者的血液样本及对增生甲状旁腺组织进行检测,发现在SHPT患者的血液样本及组织样本中CHI3L1的表达水平与患者的PTH水平呈正相关。（4）PTH对成骨细胞诱导分化的影响及CHI3L1的表达观察小鼠成骨细胞在不同浓度的PTH持续刺激下的生物学特性及CHI3L1的表达变化。1.细胞活力水平:给予不同浓度的PTH刺激MC3T3-E1的早期,与对照组相比PTH给药组均可以使细胞活力增强;而当持续给药48小时后与对照组的细胞活力相对,PTH持续给药组均出现了不同程度的细胞活力受抑制,且受抑制程度与PTH浓度呈正比。2.细胞成骨及破骨水平:不同浓度PTH刺激成骨细胞的各个时间点成骨因子Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx-2）的表达量逐渐升高,且与PTH的浓度呈正相关。在持续PTH给药48时观察骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）及骨钙素（Osteocalcin,OC）在PTH 500ng/ml浓度时出现表达量的拐点,当PTH浓度达到500ng/ml时出现其表达量由逐渐升高转变为表达量逐渐下降;相对应的,核因子κB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,Rankl）表达量由逐渐下降转变为逐渐升高。提示在PTH 500ng/ml持续作用成骨细胞48h时,破骨细胞活动开始逐渐活跃。3.细胞凋亡水平:在持续PTH给药48h时观察抗凋亡因子B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）在PTH 5000 ng/ml浓度时出现表达量的拐点,大于5000ng/ml的PTH在持续给药48h后出现Bcl-2由表达量升高转变为表达量逐渐下降;相对应的,促凋亡因子（Bcl-2-associated X,Bax）表达量由逐渐下降转变为逐渐升高。提示在PTH 5000ng/ml持续作用成骨细胞48h时,细胞凋亡活动开始逐渐活跃。通过Tunel染色及流式细胞术也印证了这一观点。4.CHI3L1高表达:在5000ng/ml PTH持续作用小鼠成骨细胞48h时CHI3L1的表达量达到最佳检测值。（5）CHI3L1促进PTH诱导的MC3T3-E1成骨细胞凋亡1.通过q RT-PCR及Western blot对构建的过表达CHI3L1及敲除CHI3L1稳转株进行CHI3L1表达量的检测,提示CHI3L1慢病毒成功感染小鼠成骨细胞。2.通过流式细胞术检测细胞周期发现KD-CHI3L1出现了S期的阻滞。3.在PTH 5000ng/ml持续作用48h时观察到OE-CHI3L1/KD-CHI3L1相比对照组对成骨因子Runx-2及OC依然是呈现促进其表达的趋势;OE-CHI3L1的OPG相比对照组表达量明显下降,Rankl表达量逐渐升高,促进凋亡蛋白Bax及Caspase-3表达量明显升高,抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达量明显下降。Tunel染色及流式细胞术进行细胞凋亡检测提示OE-CHI3L1组细胞凋亡较对照组明显增加,KD-CHI3L1组细胞凋亡水平较对照组明显减轻。（6）CHI3L1通过P38/FOXO1信号通路促进PTH诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。1.P38/FOXO1通路信号在大剂量的PTH持续给药诱导细胞凋亡48h,Western blot检测结果表明:p-P38/P38及FOXO1的相对表达量较对照组呈剂量依赖性逐渐升高。2.与Ctrl+PTH组相比,OE-CHI3L1+PTH组细胞p-P38/P38及FOXO1相对表达量升高,KD-CHI3L1+PTH组p-P38/P38及FOXO1明显下降。加入P38-MAPK抑制剂（SB-203580）后,Ctrl+PTH+SB、OE-CHI3L1+PTH+SB组、KDCHI3L1+PTH+SB组FOXO1相对表达量分别较Ctrl+PTH、OE-CHI3L1+PTH组、KD-CHI3L1+PTH组均有下降,表明P38/FOXO1下游信号通路被抑制。加入P38-MAPK抑制剂（SB-203580）后,Ctrl+PTH+SB组、OE-CHI3L1+PTH+SB组、KD-CHI3L1+PTH+SB组相比Ctrl+PTH组、OE-CHI3L1+PTH组、KDCHI3L1+PTH组,流式细胞术及Tunel染色提示凋亡细胞比例明显下降。Western blot结果表明:抑制剂组的Bax、Caspase-3的相对表达量较相应对照组显著下降,Bcl-2的相对表达量升高。上述实验结果表明:P38-MAPK抑制剂可以抑制P38/FOXO1信号通路的激活从而减轻PTH诱导的CHI3L1慢病毒感染的MC3T3-E1细胞凋亡。结论:1.CKD-SHPT患者术前高PTH和高ALP水平是PTX术后发生低钙血症的独立危险因素,可作为评估骨代谢异常程度的重要指标;2.大剂量PTH持续刺激成骨细胞时,破骨行为更加活跃,同时出现细胞凋亡现象;3.CHI3L1作为PTX术前术后的差异表达蛋白促进了PTH诱导的成骨细胞凋亡;4.CHI3L1通过激活P38/FOXO1信号通路促进PTH诱导成骨细胞凋亡。