米格列醇是1-脱氧野尻霉素的N-羟乙基衍生物,是α-葡萄糖苷酶抑制剂。临床上已作为治疗2型糖尿病的首选药物。目前,其主要通过以1-脱氧野尻霉素为底物纯化学合成和以N-羟乙基葡萄糖胺为底物化学生物组合法合成,前者反应步骤较多、生产成本高,其底物1-脱氧野尻霉素无论从植物中提取或化学合成或发酵生产,工艺均较复杂；后者采用产山梨醇脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)全细胞作为生物催化剂,催化N-羟乙基葡萄糖胺反应用化学生物组合法合成米格列醇的工艺具有反应步骤少、生产成本低的优势,但通过发酵获得的全细胞,其细胞膜山梨醇脱氢酶总活力和储藏稳定性均较低,严重制约了此工艺的进一步开发和应用。本论文的目的是获得具有高活力山梨醇脱氢酶的G. oxydans菌株,以其全细胞作为生物催化剂,对化学生物组合法合成米格列醇的工艺进一步改进,进一步提高米格列醇的产量。通过对G. oxydans A1的培养和其细胞膜山梨醇脱氢酶活力的研究表明,碳源浓度较高时,抑制细胞生长。山梨醇脱氢酶催化生物转化反应时,反应液中溶氧量越大,反应需求的细胞浓度越大,反应速率越大；当反应液中的溶氧量一定,细胞浓度达到临界值时,反应速率最大；山梨醇脱氢酶的最适作用温度为28℃,最适pH值为5.5。以G. oxydans A1为出发菌株,通过紫外线诱变结合梯度平板半理性筛选获得一株高山梨醇脱氢酶活力突变株G. oxydans Gouv2007,其单位生物量的山梨醇脱氢酶活力与原始菌株持平,而生物量比原始菌株提高了11.2%,培养时间缩短了6小时。研究二者的发酵动力学,结果表明均符合底物抑制动力学模型,其最大比生长速率分别为0.2165h-1和0.2507h-1,Ki分别为1.5069g／L和3.9663g／L,突变株部分地解除了底物抑制现象。单因素优化实验表明,碳、氮源分别为山梨醇、酵母浸粉,无机盐为硫酸镁和磷酸氢二钾,摇床转速为200r／min,装液量为20%,培养温度为28℃,培养基初始pH自然时,突变株的生物量和山梨醇脱氢酶的活力最高。采用中心组合设计和响应面分析,获得了细胞生长的最优培养条件：山梨醇18.0g／L,酵母浸粉10.0g／L,磷酸氢二钾3.0g／L其最终生物量达到1.333g／L,比未优化前提高了34.6%；在2L发酵罐中放大培养,生物量达到了5.580g／L,单位生物量的山梨醇脱氢酶活力为1.1U／mg干细胞。对突变菌株细胞膜山梨醇脱氢酶性质作初步研究,最佳酶反应条件为：pH5.5,28℃。单批次操作稳定性较高,在转化反应的整个过程中基本没有失活；当底物耗尽时,连续进行两次补加底物,酶活力降低较小；多批次操作稳定性较差,首次重复使用时,酶活力有较小的降低,二次重复使用时,酶活力丧失40%。在山梨醇培养基中梯度增大甘油浓度诱导提高山梨醇脱氢酶活力,甘油浓度为20.0g／L时,该酶的单位生物量活力达到1.9U／mg干细胞,比未诱导的提高了63%。总活力达到2.2U／mL发酵液,比未诱导的提高了30.5%。其储藏稳定性也相应提高,菌体静息细胞储存一个月时,酶活力保留75%,未经诱导的只保留30%。酶动力学显示,其Ks由诱导前的51mmol/L减小到38mmol/L,对底物的亲和力增加了1.34倍。由此,建立了甘油诱导高活力山梨醇脱氢酶的生产工艺。以葡萄糖和乙醇胺为原料,合成N-羟乙基葡萄糖胺,葡萄糖转化率为89%；在通气搅拌下,用高活力的山梨醇脱氢酶催化N-羟乙基葡萄糖胺反应生成6-脱氧-6-氨基(N-羟乙基)-α-L-呋喃山梨糖；再加氢还原为米格列醇,分别利用TLC和离子交换层析分离检测到从N-羟乙基葡萄糖胺到生成米格列醇两步反应的总底物转化率为77.3%和73.6%,产物得率为62.7%。对合成的米格列醇经提纯后得到白色固体粉末,测得熔程为142-147℃,经红外光谱和核磁共振氢谱分析,该产物与米格列醇标准品谱图吻合良好。