迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种短杆状革兰氏阴性致病菌,能造成多种淡、海水鱼类的出血性败血症。本实验室从发病的大菱鲆体内分离得到了迟钝的强毒株EIB202。因为其强的致病能力,迟钝爱德华氏菌可以用来构建重组细菌载体疫苗。通过对其进行了全基因组测序,并对E.tarda EIB202的毒力因子进行了分析,构建了有效的疫苗株WED。本课题以WED为抗原呈递的载体,构建了无抗的多效价载体疫苗。活载体疫苗在使用过程中有可能会被释放到环境中,不论是在医药还是环境方面都会产生较大的影响,例如抗性基因向环境中的传播等。将E. tarda EIB202的asd基因删除后构建了DAP依赖型的缺失突变株,这种突变株在外界环境不含有DAP不能正常生长。Asd是革兰氏阴性细菌细胞壁合成过程中重要的一个酶,如果缺失将会导致细菌的裂解死亡。用没有启动子的野生型asdB基因替换质粒上的抗生素基因作为新的筛选标记,构建了一系列的不同拷贝数的无抗质粒。将这些质粒转化到疫苗株WED△asdB体内,构建了平衡致死系统。为了获得高效的生长回补效率,通过改变asdB基因的SD序列以及起始密码子优化了这一系列表达系统。选取最优的表达系统,使用体内诱导表达启动子Pdps将报告基因gfp引入无抗表达系统并测定GFP在体外以及体内表达效率。最后,用新型的无抗系统表达了异源抗原gapA34(gapA34编码嗜水气单胞杆菌的甘油醛三磷酸脱氢酶),构建多效价的载体疫苗,通过斑马鱼和大菱鲆评价了多效价疫苗的免疫保护力。