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目的:二甲双胍(metformin)作为临床一线的治疗Ⅱ型糖尿病的双胍类口服降糖药,除具有降糖和保护心血管作用外,还可通过抑制内皮细胞(Endothelial cells,ECs)的增殖、迁移以及相关信号传导通路,发挥抗血管生成作用。然而,其具体调控细节及作用机制还不清楚,有待进一步研究和阐释。microR-21(miR-21)广泛表达于多种组织,并且参与多种心血管疾病的发生发展。研究显示,miR-21通过靶向抑制多种靶基因,进而参与调节内皮细胞的增殖、迁移和凋亡等功能,在血管生成中扮演着重要的角色。最新研究揭示,二甲双胍能够诱导内皮细胞中部分miRNA表达异常,其中二甲双胍处理可导致miR-21表达显著降低,提示是否存在二甲双胍通过诱导miR-21下调表达参与对内皮细胞抑制以及抗血管生成?因此,本文将从miRNA的视角研究二甲双胍抗血管生成的分子调控机制,研究二甲双胍处理过程中miR-21的上游影响因子和下游靶向调控因子及其可能调节的信号通路,进一步查明miR-21介导的对内皮细胞的增殖、迁移能力以及对体外血管生成的影响,从而探讨二甲双胍诱导的miR-21信号通路在血管生成中的作用及机制,为临床预防和治疗心血管类疾病提供新的治疗靶点及理论依据。方法:1.qRT-PCR研究不同浓度、不同时间点二甲双胍处理对miR-21表达的影响;2.“CCK-8法”和“细胞划痕实验”分析二甲双胍联合mir-21模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitors)及相应阴性对照(nc)处理对huvecs的增殖、迁移能力的影响,进一步应用“基质胶小管形成实验”分析对huvecs体外血管生成的调节;3.靶基因生物信息学预测mir-21可能的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验验证mir-21对靶标(pten和smad7)mrna的结合位点及作用;4.qrt-pcr和westernblot检测huvecs中mir-21对靶标(pten和smad7)mrna和蛋白表达的调控;5.结合二甲双胍处理和体外干预mir-21表达(上调或下调),调查二甲双胍对上游tgf-β1及下游靶标pten和smad7表达以及akt,rk1/2,smad2/3等磷酸化水平的影响,进一步利用tgf-βreceptorikinase(tgf-βr1)抑制剂(ly2157299)调查抑制tgf-β1对mir-21及其靶标及下游信号通路的影响,并探讨mir-21表达上调或下调对二甲双胍调节的huvecs增殖、迁移和体外血管生成的影响,查明具体调控细节并阐释相关分子机制。结果:1.二甲双胍呈剂量和时间依赖性的下调huvecs中mir-21的表达,浓度为20mm作用24h时下调最为显著;2.“cck-8”法和“细胞划痕实验”结果表明,二甲双胍能通过下调huvecs中mir-21的表达进而抑制huvecs的增殖、迁移能力,进一步发现,上调huvecsmir-21(转染mir-21mimic)后,二甲双胍对huvecs增殖和迁移的抑制效应明显降低;相反的,下调mir-21(转染mir-21inhibitor)后,明显增加二甲双胍对huvecs增殖和迁移的抑制效应;3.靶基因生物信息学分析显示pten和smad7两个基因的mrna3’-utr存在与mir-21结合的互补位点;进一步荧光素酶报告基因实验证实,mir-21能够直接靶向调控pten和smad7。4.qrt-pcr和westernblot结果显示,mir-21能显著上调huvecs中靶标pten和smad7mrna和蛋白表达;5.二甲双胍能通过下调tgf-β1诱导的mir-21的表达下调,导致靶标pten和smad7mrna和蛋白表达上调,并抑制下游pi3k/akt,erk1/2,smad2/3等蛋白磷酸化;进一步研究结果表明,上调huvecs中mir-21(mir-21mimic)明显减弱二甲双胍对akt,erk1/2和smad2/3蛋白磷酸化的抑制效应;相反,下调mir-21(mir-21inhibitor)明显增强二甲双胍对akt,erk1/2和smad2/3蛋白磷酸化的抑制效应;7.基质胶小管形成实验结果显示,二甲双胍可通过下调huvecs中mir-21的表达抑制其体外小管形成能力,并且上调huvecs中mir-21(mir-21mimic)后,二甲双胍对huvecs体外小管形成的抑制效应明显减弱;相反的,下调mir-21(mir-21inhibitor)后,二甲双胍对huvecs体外小管形成的抑制效应显著增强。结论:1.二甲双胍呈剂量和时间依赖性的下调huvecs中mir-21的表达。2.二甲双胍能通过下调tgf-β1诱导的huvecs中mir-21的表达,进而导致靶标pten和smad7的mrna和蛋白表达升高,从而抑制huvecs中akt,erk1/2,smad2/3等磷酸化。3.二甲双胍通过下调huvecs中mir-21表达,进而靶向负调控其靶标及下游相关信号通路,最终抑制huvecs的增殖、迁移和小管形成,证实二甲双胍发挥抗血管生成作用。4.本研究表明,上调mir-21的表达能够显著减弱二甲双胍对huvecs增殖、迁移能力的抑制效应,降低对HUVECs中Akt,ERK1/2和SMAD2/3蛋白磷酸化水平的阻抑,从而阻止二甲双胍的抗血管生成能力;相反的,下调miR-21能够显著增强二甲双胍对HUVECs增殖、迁移的抑制作用,增加对HUVECs中Akt,ERK1/2和SMAD2/3蛋白磷酸化水平的阻抑,从而增强二甲双胍的抗血管生成能力。