随着我国经济物质水平的提高,2型糖尿病的发病率逐年上升,作为糖尿病微血管并发症的之一—糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)其发病率也逐年升高,在我国也是导致终末期肾病(End stage renal disease,ESRD)的第二大病因。DKD早期特征性表现为微量白蛋白尿,继而出现持续性白蛋白尿排泄率增高、水肿、高血压、进行性肾功能不全,最终发展至ESRD。糖尿病肾脏病病理特征是细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)成分在肾小球系膜和肾小管间质进行性沉积,最终发展为不可逆的肾脏纤维化。另外,体内环境紊乱如高血脂、高血糖、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin angiotensin aldosterone system,RAAS)激活等多种因素导致肾脏系膜细胞损伤,释放诸如单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)等多种炎症因子。这些炎症因子可以通过激活核巨噬细胞聚集,加重ECM沉积;也可以通过刺激转化生长因子-β、结缔组织生长因子等多种生长因子的表达,引起纤维蛋白原、胶原蛋白Ⅳ等多种胶原代谢失衡,ECM积聚,导致肾脏纤维化。近年来众多学者从分子水平对DKD的发病及进展进行研究,发现多条信号通路如 AMPK(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase)、JNK(c-Jun N-terminal kinase)等以及氧化应激、内质网应激水平的异常介导DKD的发生发展,但DKD的机制尚未完全明了,目前也缺乏针对糖尿病肾脏病进展行之有效的治疗方法。肾小球系膜病变是糖尿病肾脏病最突出的病理改变之一,系膜细胞是位于肾小球内主要的固有细胞,其细胞核较小、形态不规则,有突起可伸入内皮细胞与基底膜之间,亦可经内皮细胞间隙突入毛细血管腔内。系膜细胞可通过形态改变调节毛细血管管径大小影响其血流量大小。系膜细胞也可以通过分泌肾素和多种酶类物质,局部调节肾小球内血流量。系膜细胞发生表型改变,由正常表型转化为具有增殖或分泌表型可能是ECM合成增加的细胞学基础。α-SMA在正常的成熟系膜细胞几乎不表达,但在长期高糖刺激下可重新表达,其表达再现是系膜细胞表型改变的标志物。系膜细胞表型改变是糖尿病肾脏病进展和慢性肾脏纤维化的重要原因,其主要表现肾小球系膜细胞肥大、α-SMA的异常表达、ECM大量分泌等。研究发现基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)表达与系膜细胞表型改变密切相关,其MMPs表达降低与ECM堆积密切相关,最终加重肾小球纤维化。过氧化物酶体增值体激活受体(PeroxisomeProliferator Activated Receptors,PPARs 是核激素活化的受体和转录因子,目前已发现其有三个亚型:PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ。一系列的研究表明,PPARs在调节脂类代谢、胰岛素敏感性,免疫反应、细胞生长和分化中都起了重要作用,PPARs还参与代谢综合征:如胰岛素抵抗,高血脂、高血压、动脉粥样硬化、微量白蛋白尿。PPARy是一类配体激活的核受体转录因子,属于激素核受体超家族。它在脂肪组织中高表达,在调节脂类代谢、胰岛素敏感性、炎症及免疫调节、细胞外基质调节及细胞生长和分化中都起了重要作用。抗糖尿病药物胰岛素增敏剂四氢噻唑烷二酮类药物(Thiazolidinedione,TZD),如罗格列酮和曲格列酮,是PPAR-γ特异性配体。TZD与PPAR-γ结合后,调控与胰岛素效应有关多种基因的转录。越来越多的临床及循证医学证据表明,TZD类对保护糖尿病肾脏病及非糖尿病性肾病患者的肾功能有着很大的益处,但其机制仍不十分明确。PPAR-α主要分布在一些脂肪分解代谢活跃的器官或组织(如肝、心、脂肪组织、骨骼肌、血管内皮细胞、动脉粥样斑块等),是脂肪酸氧化酶基因必要的转录调控因子,调节脂类的摄取及氧化,调节氨基酸的代谢,且参与止血、脂代谢紊乱、炎症反应、冠心病和动脉粥样硬化等疾病的病理生理过程。研究显示,过多的胆固醇、三酰甘油等脂质在肾脏异位沉积与DKD发生及肾小球硬化有关[1],而PPARα激动剂非诺贝特能通过缓解脂毒性而减轻DKD小鼠的微量白蛋白尿,其具体机制为激活AMPK信号通路、改善氧化应激与炎症状态[2]。最近的报道显示,中成药黄葵能通过激活PPARα/y受体进而抑制内质网应激与JNK活化,减轻DKD的炎症和肾小球损害[3]。脂质代谢在慢性肾脏病中的作用越来越受到关注,如脂毒性学说:过多的胆固醇、三酰甘油等脂质在肾脏异位沉积与DKD发生及肾小球硬化有关。DKD属于中医消渴病肾病范畴,病名提示:病位主要在肾。其基本病机为:脾气亏损、脾不摄精、精气下陷。肾不藏精、摄精无权、精气下泄。早期:气血两虚、淤血阻络。中期:脾肾不足、虚阳上亢、水湿潴留、泛滥肌肤、夹有淤血。晚期:浊毒内停、耗伤气血、肾阳衰败、水饮不化、上凌心肺。病程始终贯穿肾元受损的病理。临床治疗注重护肾培元。在中医中药方面,有上千年治疗糖尿病肾脏病的历史,对降低蛋白尿,延缓肾功能减退以及改善生活质量等方面具有丰富的临床治疗经验。虽然临床经验和相关实验研究提示一些中药方剂或有效单体具有预防及治疗DKD的作用,但缺乏相关防治DKD的确切机制及相关具体通路研究,其临床推广遇到瓶颈。临床研究中发现大黄、黄芪苷、槲皮素、黄芩苷、冬虫夏草等中草药制剂或知柏地黄丸、盐酸小檗碱、当归补血汤和五苓散、糖肾方等中成药对DKD有一定的保护作用,提示中医中药可为DKD的防治提供有价值的指导。落新妇苷(Astilbin)是从传统中药土茯苓中提取的黄酮类化合物,据文献报道,落新妇苷具有多种显著的生物学活性,具有抗炎症、抗氧化功能。近年来又有报道称落新妇苷有显著的选择性免疫抑制作用,抑制T细胞活化和迁移,具有不同于环孢霉素A的免疫抑制活性,作为一种新的免疫抑制剂,落新妇苷可用于免疫相关疾病的治疗。近年来研究发现落新妇苷在大鼠缺血再灌注模型中可通过抑制趋化因子MCP-1及细胞因子IL-6和IL-18的产生减轻肾脏缺血再灌注的损伤,但其在DKD防止中的作用及机制尚无相关研究报道。课题组前期研究发现落新妇苷可以激活PPARα/y,从而改善胰岛素敏感性,并可以部分逆转肾小管上皮转分化。由此我们推测,落新妇苷可能通过上调PPARα/γ表达抑制糖尿病肾脏病肾脏纤维化的发生发展。本研究我们首先利用细胞因子芯片技术分析不同类型糖尿病患者外周血炎症相关因子和T细胞亚群的变化;并在明确PPARα/γ参与糖尿病肾病的基础上,通过糖尿病肾病患者肾脏组织研究、体外细胞试验及构建糖尿病大鼠肾病模型,从而阐明落新妇苷在减轻糖尿病肾病上的作用及其机制,为糖尿病肾病的治疗提供新的手段。第一部分不同类型糖尿病T细胞亚群和相关炎症因子的分析目的:探讨不同类型糖尿病T细胞亚群和相关炎症因子的分析。方法:选取正常对照组20例、2型糖尿病20例、经典1型糖尿病18例、暴发型1型糖尿病12例,签署知情同意书后抽取外周血,分离血细胞,分别检测20种细胞因子的水平及T 细胞亚群,通过检测 CD4+CD25+FOXP3+、CD8+CD44+、CD4+CD44+、CD4+NKG2D+、CD4+IFN-γ+细胞、NK+NKG2D+细胞的频率来分析1型糖尿病患者普通型与暴发型外周血相关淋巴细胞的频率与表型;分离血清,-80℃冻存,利用细胞因子芯片检测不同临床表型血清炎性细胞因子的水平,比较1型糖尿病患者普通型与暴发型血清相关炎性细胞因子的变化。结果:1型糖尿病患者CD4+CD25+Foxp3+细胞频率较正常对照组明显降低,CD4+IFN-γ+细胞频率明显增高,CD8+IFN-y+细胞频率明显增高,具有趋化潜能CD4+、CD8+细胞的频率明显增高;暴发型1型糖尿病患者Th1细胞相关细胞因子较普通1型糖尿病患者显著增高,其中 TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MIP-1β、IL-12p70、IP-10、IFN-γ、IL-9 明显升高,而IL-17A,IL-15和IL-10在普通1型糖尿病、暴发型1型糖尿病,2型糖尿病中无明显差异。MCP-1,MIP-1a,Fractalkine和MCP-3在各组之间分布无明显差异。结论:1型糖尿病患者外周血Treg和Th1细胞失衡,Treg明显降低,而Th1细胞亚群明显升高,暴发型1型糖尿病患者Th1细胞相关细胞因子较普通1型糖尿病患者显著增高。第二部分PPARα/y在糖尿病肾脏病肾活检组织中的表达目的:观察PPARα/γ在糖尿病肾脏病肾活检组织中的表达水平。分析PPARα/y与肾脏纤维化是否具有相关性。方法:糖尿病肾脏病患者共18例,男10例,女8例,平均年龄72岁9个月。正常对照组肾脏组织(肾脏肿瘤切除术后肿瘤周边肾组织)共8例。应用免疫组化检测活检肾组织中PPARα/y的表达。分析PPARα/y与肾脏病理评分的相关性。结果:对照组免疫组化染色结果显示肾脏组织都可见PPARα/γ表达,但在小管中近段肾小管表达最多,远端小管、集合管表达相对较少,在肾小球中系膜细胞表达较多,糖尿病肾脏病的活检肾组织PPARα/γ表达量较对照组明显减少,减少近50%。半定量分析显示PPARα/γ减少与肾脏损伤病理评分呈负相关。结论:PPARα/γ在糖尿病肾脏病患者肾组织中表达减少,PPARα/γ在糖尿病肾脏病肾脏纤维化中与肾脏病理评分有负相关性。第三部分落新妇苷通过激活PPARα/γ抑制高糖诱导的系膜细胞表型改变目的:在体外揭示落新妇苷刺激对高糖诱导的系膜细胞表型改变的影响。方法:体外培养人系膜细胞,应用不同浓度的高糖(5.5,15,20,30mM)刺激,观察高糖对系膜细胞表型改变的影响。落新妇苷(25mg/L)预处理系膜细胞,再给予高糖(30mM)刺激,观察落新妇苷对高糖诱导的系膜细胞表型改变的影响。采用Western blotting和qRT-PCR检测PPARα/γ以及成纤维细胞标志蛋白α-SMA的表达及MMP-9的表达。结果:(1)PPAR-γ蛋白水平在高糖浓度为15mM即有明显抑制(35%,P<0.01),浓度为30mM时抑制达到最大80%(P<0.01),PPAR-γ mRNA水平水平也在高糖浓度15mM即有明显降低(45%,P<0.01),并诱导系膜细胞表型改变,MMP-9在高糖浓度为15mM时明显降低(P<0.05),而α-SMA明显升高(P<0.05),随着高糖刺激浓度增加,上述差异性更为显著。(2)体外培养人系膜细胞,经落新妇苷(25mg/L)刺激24h,PPAR-α表达明显增加,约升高2倍(P<0.05);而PPAR-γ也增加到1.5倍,增加55%(P<0.05)。(3)高糖刺激后,HG组α-SMA表达较正常对照升高约2倍(P<0.05),而MMP-9明显降低(降低约45%,p<0.05),而给予落新妇苷能明显部分抑制高糖诱导的α-SMA升高(较HG组降低约30%,P<0.05)及阻断MMP-9的降低(较HG组升高约55%,P<0.01)。结论:落新妇苷通过激活PPARα/γ的表达,抑制人系膜细胞表型改变,提示落新妇苷在维持人系膜细胞正常功能中发挥重要作用。第四部分落新妇苷在大鼠体内对糖尿病肾脏病的影响目的:分析落新妇苷在体内对糖尿病肾脏病的作用及相关机制研究。方法:选择70只大鼠(45-50d),体重为200-220g的雄性健康SD清洁级大鼠(购自扬州大学实验动物中心),适应性喂养1周后,随机分为正常对照组(Cntl,10只),糖尿病肾脏病组(DN组,20只),糖尿病肾脏病+低剂量落新妇苷组(DN-LD-Ast组,10只),糖尿病肾脏病+中剂量落新妇苷组(DN-MD-Ast组,10只),糖尿病肾脏病+高剂量落新妇苷组(DN-HD-Ast组,10只),糖尿病肾病+罗格列酮组(DN组+RGZ组,10只)。对照组以普通饲料喂养,DN组使用高脂饲料喂养,12周后,后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(40 mg/kg,腹腔内一次性注射),对照组腹腔注射同等剂量的0.1mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(Ph=4.4)。一周检测一次血糖,代谢笼收集24h尿,测尿微量白蛋白,微量白蛋白/肌酐>30mg/g为糖尿病肾脏病造模成功。落新妇苷剂量分别按1.25(LD-Ast)、2.5(MD-Ast)、5(HD-Ast)mg/kg/d溶解在生理盐水中腹腔注射,12周后水合氯醛麻醉处死小鼠,留取血清、尿及肾组织标本、肝脏标本。检测血清生化指标(甘油三酯,胆固醇,低密度脂蛋白、高密度脂蛋白,血肌酐,尿素氮,白蛋白等),Western blotting和qRT-PCR检测PPARα/γ的表达以及成纤维细胞标志蛋白MMP-9、α-SMA和desmin的表达,肾脏病理TGF-β1、Coll Ⅳ免疫组化,PAS染色光镜下观察肾组织形态学改变。结果:(1)DN大鼠空腹血糖较正常组明显异常,中位数26.24mmol/L,升高具有统计学差异,低剂量和中剂量空腹血糖较正常对照组无明显差异,而高剂量组能明显改善空腹血糖;DN大鼠体重较正常对照组明显减轻,摄水量、尿量较正常组升高十倍左右,尿蛋白明显升高,其变化有统计学意义。(2)落新妇苷干预后,不同剂量落新妇苷减轻尿蛋白的效果不一样,低剂量和中剂量落新妇苷能部分降低蛋白尿水平,但没有统计学意义,高剂量落新妇苷能显著降低尿蛋白水平,其改变有显著差异(P<0.01),在糖尿病肾脏病大鼠模型中,TGF-β1在肾小球表达较少,半定量分析提示DN组TGF-β1升高了约4倍,低剂量和中剂量落新妇苷能抑制TGFβ1的升高,较DN组降低了约25%,而高剂量落新妇苷则能降低约50%(P<0.05)。与正常对照组比较DN组CollA1明显增高,给予低剂量落新妇苷不能改善纤维化指标,而中剂量落新妇苷能部分抑制CollA1的升高(P<0.05),而高剂量落新妇苷能抑制 CollA1(P<0.01)结论:落新妇苷在体内可能通过激活PPARα/γ表达抑制糖尿病肾脏病纤维化。