论文部分内容阅读
血管紧张素转化酶是(Angiotensin Converting Enzyme,ACE,EC.3.4.15.1)是一种二肽羧基的糖蛋白酶,参与调节血压和高血压的发生中起着重要的作用。为了对ACE的生化性质、结构功能和ACE与抑制剂结合过程的研究,需要先制备出高纯度和高活力的ACE。本论文从猪肺中制备分离纯化得到高纯度ACE,研究纯化产物的酶学性质,并选择ACE抑制剂药物赖诺普利(Lisinopril)和乳清来源的ACE抑制肽VSLPEW,对ACE与抑制剂结合过程及抑制机理进行研究,主要内容如下：新鲜的猪肺作为原料,匀浆后采用超声波联合胰蛋白酶对匀浆液进行前处理后再提取猪肺ACE,结果显示两者联合处理后可以显著提高酶活力和提取率。考察了超声波处理与加入胰蛋白酶的工艺流程,并确定超声预处理的最适条件为：超声功率为360W,超声时间为3 min,浆液比为1：5,用硫酸铵沉淀,将预处理后粗提匀浆液分别利用1.6 mg·mL-1和2.6 mg·mL-1两种不同浓度的硫酸铵分级沉淀,得到的粗酶液进行透析。对透析酶液进行离子交换-超滤离心操作,得到经SDS-PAGE显示是一条电泳带的ACE纯品。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测知,该ACE相对分子质量约为69KDa比活力为0.1061 U·mg-1,纯化倍数29.48倍,酶活力总回收12.33%。研究ACE酶学性质的实验结果显示,猪肺ACE在偏弱碱性环境中具有较高的酶活力,其活力最大值在pH8.3左右,猪肺ACE的热稳定性较低,最适反应温度为40℃。考察了在不同底物浓度下的催化反应速率ACE对其的影响,双倒数作图法得出Lineweaver-Burk方程计算得到所提纯的猪肺ACE的酶反应动力学常数Km为2.7 mmol·L-1,Vmax为8.1 nmol·min-1。利用等温滴定量热法研究了奈诺普利(Lisinopril)>乳源ACEI VSLPEW与ACE结合过程的热力学参数。实验结果得到抑制剂Lisinopril、抑制肽VSLPEW抑制结合ACE的反应焓变均为正值,抑制反应过程均为吸热过程。焓变值随着温度升高呈现出线性的逐渐减少,而吉布斯自由能AG<0主要由-TAS贡献,均为熵驱动的结合反应。抑制结合过程中抑制剂Lisinopril与ACE的化学计量比接近1,抑制肽VSLPEW与ACE的化学计量比接近2。由热力学关系式推导得出抑制剂Lisinopril与抑制肽VSLPEW的ACp均为负值,分别为-20.36 kJ-1·mol-1与-3.064 kJ·K-1·mol。