心脑血管疾病是全球范围内致死率最高的疾病,而动脉粥样硬化已被证明是心脑血管疾病最常见的病理特征,是一种以中等和大动脉斑片状内膜下增厚为特征的病变,其病变过程伴随着血管硬度发生改变。血管中的平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分,其功能的改变在血管病理过程中起着重要的作用,是动脉粥样硬化发生发展进程中的重要标志之一。已有研究证明,SMC能够感知基底硬度等物理信号,并通过行为的改变来响应硬度的变化,在病变的血管与正常血管之间存在明显的不同。近年来,由于自体和异体血管来源有限等原因,组织工程血管在治疗心血管疾病方面发挥着越来越重要的作用。在血管组织工程材料制备和改良方面,大多数的研究集中在材料的制备方法、化学成分以及通过添加不同的药物或者生长因子以提高血管组织工程材料的性能,但对于材料硬度等物理性质对于材料性能的提高方面研究较少。然而,最新的研究已经表明,材料的物理性能对于细胞行为有重要的影响,我们课题组的前期研究也证明,材料的表面形貌等物理特性会对细胞形态、干细胞定向分化等产生显著性影响。但是,对于材料硬度对血管SMC的影响及其在血管重塑过程中的作用尚未见到报道。本课题的假设是,基底硬度可以通过调节SMC细胞表型的转变和细胞外基质的表达,参与血管重塑。为进一步验证我们的假设,本课题选用了具有良好的生物相容性,且表面模量可控的聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide Gel,PA)模拟不同状态下的血管硬度,研究了SMC在不同硬度条件下的差异,并探究了造成细胞差异性表现的原因。具体的研究体系如下:(1)通过调节丙烯酰胺(acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(bis-acrylamide)的比例制备了硬度分别为1 kPa、40 kPa和100 kPa的PA胶,作为细胞的体外培养体系。(2)利用人脐动脉平滑肌细胞(human umbilical artery smooth muscle cells,HUASMC)体外模拟动脉的SMC。利用以上的研究体系,本课题研究了基底硬度是否可以影响SMC细胞表型和细胞外基质的表达,以及基底硬度是通过怎样的途径对SMC产生影响,进而在血管重塑过程中起作用。本课题的研究结果主要包括如下部分:(1)初步研究结果表明,不同硬度的PA胶基底对于SMC的增殖没有影响,但是细胞形态存在明显的差异。在软基底表面(1 kPa),细胞铺展面积与细胞核面积较小,仅为2871μm~2和191μm~2;而随着基底硬度的增加,细胞铺展面积和细胞核面积也逐渐增加,当基底硬度为100 kPa时,细胞铺展面积和细胞核面积分别达到4974μm~2和302μm~2,细胞整体形态舒展,细胞骨架清晰。(2)进一步的研究发现,基底硬度与SMC表型相关标志物的表达存在紧密的关联性。SMC中合成表型标志物骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和EGF家族成员表皮生长因子(epiregulin,EREG)的表达水平随着硬度的增加而降低;而SMC中收缩表型标志物平滑肌细胞分化特异性抗原(smoothelin,SMTN)和钙调节蛋白(calponin,CNN)的情况与之相反,其表达与基底硬度呈正相关。同时,SMC中对细胞外基质有调节作用的基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和纤连蛋白1(fibronectin 1,FN1)的基因表达也与基底硬度存在线性关系,基因和蛋白质表达水平随着基底硬度的增加而降低。与此同时,转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)信号通路相关的调节因子TGF-β、Smad4以及MAPK等的基因表达也与基底硬度存在相关性,尤其是TGF-β信号通路的主要信号分子Smad2/3。磷酸化Smad2/3(phosphorylated Smad2/3,p-Smad2/3)的含量会随着基底硬度的增加而增加,提示TGF-β信号通路可以被基底硬度激活,参与对SMC的功能调控。(3)为进一步确定TGF-β信号通路在基底硬度对SMC的细胞表型和细胞外基质的调节中起到影响,使用TGF-β受体抑制剂RepSox阻断SMC的TGF-β信号通路,并通过qPCR、Western Blot以及免疫荧光染色的方法检测了相关基因和蛋白的表达。结果显示,TGF-β信号通路被阻断后,SMC胞浆中p-Smad2/3的含量不再随基底硬度的改变而变化,基底硬度对于SMC表型相关标志物SMTN、EREG、CNN、OPN以及与细胞外基质相关的MMP-2和FN1的影响也基本消失。以上结果表明,TGF-β信号通路确实对SMC的表型及其细胞外基质的调控中起了重要的作用。综上所述,本课题证明了SMC可以感知基底硬度的变化,并通过TGF-β信号通路的激活实现细胞表型的转变以及调控细胞外基质来响应硬度的改变,参与血管的重塑。这项研究结果将为血管组织工程材料的设计提供新的视角,同时本研究所建立的体外培养体系也可以成为研究动脉粥样硬化和寻找筛选有效治疗药物的工具。