背景和目的抑郁症的发病有多种原因,发病机制的研究也不局限在单纯的单胺递质假说。海马神经元的损伤和再生障碍作为抑郁症发病的病理基础越来越的得到大家的重视,研究海马神经元损伤、再生和可塑性的机制,为探索抑郁症的病理学机制提供新的线索。由于海马结构上的特殊性,与神经免疫内分泌的网络紧密相连,其中IL-1β是这个网络中的重要的细胞因子,参与了海马神经元的损伤及再生障碍。本课题前期工作已经证实,腹腔注射脂多糖、不可预料的慢性应激和腹腔注射利血平均可导致大鼠的行为性抑郁以及大鼠脑内IL-1β的含量增加；大鼠脑室内注射IL-1β可诱导抑郁样行为,脑内注射IL-1β拮抗剂可以部分改善这种行为性抑郁,同时给予腺苷受体拮抗剂caffeine和A2a受体拮抗剂同样可以部分逆转这种行为性抑郁,而给予A1和A2b受体拮抗剂却没有发现上述行为性抑郁的改善。应激前和应激过程给予阿司匹林,可降低大鼠脑内IL-1β含量同时改善应激所致的行为性抑郁。上述研究证明大鼠脑内IL-1β的升高和行为性抑郁有着密切的关系。进一步的研究发现,慢性应激所致的行为性抑郁大鼠海马神经元凋亡增加、BDNF和转录因子CREB表达减少。为了进一步明确IL-1β对海马神经元的的影响机制,本实验在海马神经元原代培养的基础上,观察IL-1β对海马神经元的活性以及细胞凋亡的影响,并从BDNF、CREB以及NMDAR角度分析机制；同时在离体实验,验证腺苷受体介导IL-1β对海马神经元损伤的具体机制；模拟海马神经元在体生存的微环境,观察星型胶质细胞刺激液对海马神经元的影响。材料和方法1、海马神经元与星形胶质细胞的培养、纯化和鉴定1.1、原代海马神经元培养、纯化和鉴定24h内SD新生鼠6-8只,断头取脑,剥离脑膜,去除大脑皮质,分离两侧海马,海马组织剪成0.5mm3大小,0.25%胰酶消化,室温下15min,吹打后收集细胞混悬液,400目的尼龙网过滤,按照1×106/ml单细胞种植。培养第四天用阿糖胞苷(2.5-5.0)μg/ml抑制胶质胞和纤维母细胞的生长。用神经元特异性表达的NSE单克隆抗体行免疫细胞化学染色,鉴定神经元。1.2、星型胶质细胞的分离纯化和鉴定24h内SD新生鼠4只,断头取脑,剥离脑膜,分离大脑皮质,制备神经胶质细胞单细胞混悬液。培养30天的胶质细胞进行胰酶消化法初步分离星形胶质细胞,定轨摇床法纯化星形胶质细胞,GFAP试剂行免疫细胞化学染色,鉴定星形胶质细胞。2、MTT法检测海马神经元的活性分别以IL-1β、非特异性腺苷受体阻断剂caffeine和IL-1β+caffeien孵育海马神经元48h,用MTT法检测其活性；以IL-1β、caffeine分别刺激星形胶质细胞12h,去除上清液后换新鲜培养液,12h后收集星型胶质细胞上清液,MTT法检测该上清液对海马神经元活性的影响。3、Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测检测细胞凋亡Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测检测IL-1β和caffeine对体外培养的海马神经元凋亡的影响。4、P-CREB、NMDAR检测免疫细胞化学方法检测P-C-REB、NMDAR (2A/2B)的表达。5、IL-1β和BDNF检测BDNF和IL-1β以ELISA法检测。6、统计方法应用Excel 2003和SPSS 13.0统计软件进行统计分析。结果以均数±标准差(x)表示,采用方差分析进行比较。以P<0.05为差异具有显著性,P<0.01为差异具有高度显著性。1、海马神经元原代培养、形态学观察、鉴定海马神经元体外培养2h,大部分细胞即可贴壁,此时细胞呈圆形并且透亮,细胞密度较高,4-5小时后部分细胞长出突起,48小时候大部分神经元长出突起,长度明显增加,细胞体饱满,透亮,折光性好,3-4d突起会继续增多增长,第5d神经元突起之间形成网络,聚集现象增多。NSE免疫细胞化学鉴定海马神经元,DAB染色,并计数原代培养神经元中的阳性细胞数。结果显示：视野布满棕黄色阳性细胞,神经元细胞体呈椭圆形、三角形、不规则形,神经突触连接成网。NSE阳性细胞率为95%以上。2、星形胶质细胞、形态学观察及鉴定胶质细胞胰酶消化初步分离后,GFAP免疫细胞化学染色.结果显示,GFAP阳性细胞率仅在75%以上。进一步行定轨摇床法纯化星形胶质细胞,镜下观察,细胞贴壁生长良好,可见星形胶质细胞胞突明显,长短不一,胞质丰富,胞内可见清晰的卵圆形细胞核。GFAP免疫细胞化学染色,显示视野内布满棕褐色的阳性细胞,95%以上的细胞为阳性细胞。结果表明,定轨摇床法可以得到高纯度的星形胶质细胞,为实验提供了单一的星形胶质细胞。第二部分IL-1β对海马神经元活性的影响及其机制分析1、IL-1β对海马神经元活性的影响体外研究表明,IL-1β可以导致大鼠的行为性抑郁,生命早期应激和抑郁的大鼠脑内IL-1β含量增加。直接观察IL-1β对海马神经元活性的影响,并模拟神经元生存的胶质细胞外环境,观察星形胶质细胞上清液对海马神经元的影响。①、IL-1β对体外培养海马神经元活性的影响IL-1β(0、5、10、20) ng/ml孵育海马神经元48h, MTT法检测海马神经元的活性。结果显示,IL-1β浓度为(5、10、20) ng/ml时0D值为(0.56±0.24,0.42±0.14,0.42±0.11),与正常组(0.95±0.30)比较,差异具有显著性(分别为P<0.05,P<0.01,P<0.01；ANOVA)。结果表明,IL-Iβ降低体外海马神经元的活性。②、IL-1β刺激过的星形胶质细胞培养上清对海马神经元活性的影响IL-1β按照浓度(0、1、10、100) ng/ml孵育星型胶质细胞12h,去除上清液后冲洗,换新鲜培养液,收集上述培养液孵育海马神经元48h, MTT法检测海马神经元的活性。结果显示,IL-1β刺激的星形胶质细胞培养上清液孵育的海马神经元0D值为(0.78±0.03,0.76±0.01,0.64±0.04),与对照组(0.85±0.02)比较,差异具有显著性(P<0.05,P<0.01,P<0.001).结果说明,IL-1β刺激的星型胶质细胞培养上清液显著降低海马神经元的活性。③、IL-1β对星形胶质细胞产生IL-1β的影响上述②收集的星形胶质细胞培养上清降低海马神经元的活性,为分析其中的机制。ELISA法检测上清液中IL-1β的含量。结果显示,与对照组(未加IL-1β刺激的星型胶质细培养上清)含量(12.84±0.3.37) pg/ml相比,1ng/ml的IL-1β刺激过的星形胶质细胞培养上清0D值(9.16±0.5.06) pg/ml,差异不具有显著性(P>0.05); (10、100) ng/ml的IL-1β刺激过的星形胶质细胞培养上清中IL-1β含量为(17.58±3.58,17.86±0.90) pg/ml,与对照组比较,差异具有显著性(P<0.05, P<0.05, ANOVA)④、IL-1β刺激过的星形胶质细胞培养上清对海马神经元上清中IL-1β含量的影响以上述②中的IL-1β刺激过的星形胶质细胞培养上清孵育海马神经元48h, ELISA法检测上清液中IL-1β含量。结果显示,IL-1β刺激的星形胶质细胞培养上清孵育海马神经元的实验组0D值为(0.15±0.03,0.15±0.004,0.13±0.01),与对照组(0.20±0.01)比较,差异具有显著性(P<0.01, P<0.01, P<0.01, ANOVA)。结果表明,IL-1β刺激的星形胶质细胞培养上清孵育海马神经元中,IL-1β含量显著降低。2、IL-1β对海马神经元凋亡的影响IL-1β按照浓度(0、5、10、20) ng/ml孵育海马神经元48h, Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测。结果显示,IL-1β孵育海马神经元48h,IL-1β各个实验组PI/FITC染色百分比为(11.6±5.82,12.06±4.46,9.4±3.11),与正常组(3.94±1.63)比较明显升高,差异具有显著性(p<0.01, P<0.01,P≤0.05,ANOVA)。IL-1β各个实验组FITC染色百分比为(2.12±1.14,2.02±1.15,2.14±1.25),与正常组(1.54±1.03)比较,变化不具有显著差异性(P>0.05)。结果说明,海马神经元受IL-1β的刺激48h,细胞凋亡方式以凋亡晚期和坏死细胞为主。3、IL-1β对神经元产生BDNF的影响①、IL-1β对原代海马神经元合成和分泌BDNF的影响用IL-1β(0、5、10和20)ng/ml孵育海马神经元48h, Elisa法检测上清液中BDNF含量。结果显示,与正常组[(6.20±0.88)pg/ml]比较,各个加药组上清液中BDNF为[(4.33±0.35,4.45±0.18,3.95±0.18) pg/ml],含量显著减少,差异具有显著性(P<0.05, P0.05<P<0.05, ANOVA)②、IL-1β刺激过的星型胶质细胞培养上清对神经元分泌BDNF的影响用IL-1β刺激过的星型胶质细胞培养上清液孵育海马神经元48h, ELISA法检测上清液中BDNF含量。结果显示,与对照组IL-1β0ng/ml刺激的星形胶质细胞培养上清[(15.66±0.95) pg/ml]相比,实验组中的BDNF[(9.24±0.63,11.49±1.51,9.99±1.13)pg/ml]含量显著减少(P<0.01,P<0.01,P<0.01, ANOVA).4、IL-1β对海马神经元P-CREB表达的影响IL-1β孵育的海马神经元,行P-CREB免疫细胞化学染色,结果显示：IL-1β浓度为10ng/ml时,P-CREB的相对阳性细胞数为(2.50±0.58)%,与正常组(4.25±0.95)%比较,数量显著减少P<0.05, ANOVA)。5、IL-1β对海马神经元NMDAR (2A/2B)表达的影响用IL-1β孵育的海马神经元,NMDAR(2A/2B)免疫细胞化学染色,结果显示：IL-1β浓度为10ng/ml时,NMDAR(2A/2B)的相对阳性细胞数为(10.75±1.71)%,与正常组(6.25±1.71)%比较,数量增加,差异具有显著性(P<0.05, ANOVA)第三部分腺苷受体非特异性拮抗剂对神经元的活性影响及其机制前期在体研究结果显示,腺苷受体介导了IL-1β诱导的大鼠行为性抑郁。故本实验在离体环境下,研究腺苷受体在工L-1β介导神经元活性损伤中的机制。结果显示,caffeine在浓度(0.1-10)mM范围未能逆转IL-1β的神经损伤,单独观察caffeine对海马神经元的影响,结果显示caffeine在浓度(0.1-10)mM范围降低海马神经元的活性。所以本实验相对于IL-1β平行观察了caffeine对海马神经元的影响。1、腺苷受体非特异性阻断剂在IL-1β介导神经元活性损伤中的机制分析①、IL-1β和caffeine共同作用对体外培养海马神经元的影响以10ng/ml的IL-1β和不同浓度的caffeine (0、0.1、1、10) mM共同孵育海马神经元48h, MTT法检测海马神经元的活性。结果显示,各实验组的0D值为(0.18±0.01,0.16±0.05,0.10±0.05),与对照组IL-1β+caffeine OmM (0.22±0.04)比较,差异具有显著性(P<0.05, P<0.01, P<0.01, ANOVA).结果表明caffeine在实验的浓度范围内(0.1-10mM)未能逆转IL-1β降低海马神经元的活性。②、IL-1β和caffeine合并应用对神经元分泌BDNF的影响以10ng/ml的IL-1β和不同浓度的caffeine (0、0.1、1) mM共同孵育海马神经元48h,检测上清液BDNF含量。结果显示,与对照组(IL-1β10ng/ml+caffeine 0 mM)中BDNF的含量[(8.91±0.29)pg/ml]比较,各实验组上清液中BDNF为[(6.33±1.396.74±1.01) pg/ml],含量显著减少(P<0.05, P<0.05, ANOVA).2、Caffeine对海马神经元的影响Caffeine按照浓度分为[(0、0.1、1、10)mM]孵育海马神经元48h,MTT法检测海马神经元的活性。结果显示,与正常组(0.26±0.03)比较,caffeine浓度0.1mM时0D值为(0.20±0.03),差异不具有显著性(P>0.05 ANOVA); caffeine浓度为1mM、10mM时0D值为(0.18±0.03,0.78±0.01),与正常组比较差异具有显著性(P<0.05,P<0.01)结果表明,caffeine降低体外海马神经元的活性。②、Caffeine刺激的星形胶质细胞培养上清对海马神经元活性的影响Caffeine刺激过的星型胶质细胞,其上清液孵育海马神经元48h,MTT法检测海马神经元的活性。结果显示,caffeine浓度为1、10mM时OD值为(0.62±0.12,0.47±0.03),与正常组(0.78±0.03)比较,差异具有显著性(P≤0.05,P<0.01,ANOVA);caffeine浓度为0.1mM时OD值为(0.67±0.15),与正常组比较差异不具有显著性(P>0.05,ANOVA)。结果表明,caffeine浓度为1、10mM刺激过的星型胶质细胞,其上清液使海马神经元的活性降低。③、Caffeine对海马神经元分泌IL-1β的影响Caffeine按照浓度[(0、0.1、1、10)mM]孵育海马神经元48h,上清液中IL-1β含量检测。结果显示,与正常组OD值(0.15±0.01)比较,10mM组OD值为(0.13±0.01)显著降低(P<0.05, ANOVA)；浓度(0.1、1)mM组OD值(0.14±0.01,0.15±0.002),与正常组比较,差异不具有显著性(P<0.05,ANOVA)3、对海马神经元凋亡的影响Caffeine按照浓度(0、0.1、1、10)mM孵育海马神经元48h, AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡试剂盒检测检测caffeine对海马神经元凋亡的影响。结果显示,caffeine各个实验组FITC染色的百分比为(2.46±1.14,2.60±1.42,2.08±1.03,ANOVA),与正常组比较(0.52±0.29)明显增加,差异具有显著性(p<0.05)。PI/FITC染色各个实验组百分比为(8.89±2.77,7.88±2.24,7.44±1.74),与正常组(6.66±2.93)比较,变化不具有显著性(p>0.05)。结果说明,caffeine对海马神经元凋亡的影响,在48h时以凋亡早期的细胞占主导。4、Caffeine对神经元产生BDNF的影响①、Caffeine对原代海马神经元合成和分泌BDNF的影响Caffeine按照浓度(0、0.1、1、10)mM孵育海马神经元48h,上清液中BDNF含量检测。结果显示,与正常组[(10.41±0.52)pg/ml]比较,各个加药组上清液中BDNF为[(8.33±0.50,8.70±0.53,8.16±0.88)pg/ml],含量显著减少(P<0.01,P<0.05,P<0.01,ANOVA)。②、Caffeine刺激过的星型胶质细胞培养上清对神经元分泌BDNF的影响用caffeine刺激过的星型胶质细胞培养上清液孵育海马神经元48h, ELISA检测上清液中BDNF含量。结果显示,与对照组caffeine 0mM刺激的星形胶质细胞培养上清[(15.66±0.95)pg/ml]相比,各个实验组的BDNF为[(7.41±0.63,7.83±0.66 7.99±0.63) pg/ml],含量显著减少(P<0.01, P<0.01, P<0.01, ANOVA)。5、Caffeine对海马神经元NMDAR (2A/2B)表达的影响用caffeine孵育海马神经元,NMDAR(2A/2B)免疫细胞化学染色,结果显示：caffeine浓度为10mM时,NMDAR(2A/2B)的相对阳性细胞数为(4.25±1.50)%,与正常组(2.25±0.50)%比较,数量明显增加,差异具有显著性(P<0.05, ANOVA)结论1、IL-1β降低体外海马神经元的活性,诱导海马神经元凋亡,其中的机制可能与CREB-BDNF表达减少,NMDAR表达增加有关系。2、IL-1β刺激过的星型胶质细胞培养上清中IL-1β增加,该上清能降低海马神经元的活性,表明IL-1β可能通过神经胶质细胞调节神经元的活性。3、腺苷受体非特异性阻断剂caffeine对海马神经元具有直接作用,无法判别腺苷受体是否参与了IL-1β介导的神经损伤作用。4、Caffeine可以诱导神经元凋亡,降低海马神经元分泌BDNF,可能是其降低海马神经元活性的原因。