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目的:
多胺（Polyamine）在原核生物和真核生物中普遍存在，是细胞生长所需的一种分子。研究表明，去甲亚精胺（Norspermidine，Nspd）作为多胺的一种，对于不同细菌生物膜起着不同的作用。Nspd最初被发现能促进霍乱弧菌（Vibriocholerae，V.cholerae）生物膜的形成。L.Hobley等人研究发现Nspd不仅能抑制枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis，B.subtilis)生物膜形成，对已形成的生物膜起到离散的作用。并且发现Nspd促进生物膜离散的作用位点为细胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）。后续不断有研究表明，Nspd对绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，S.epidermidis）、变异链球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,A.baumannii)、肺炎克雷伯氏菌(KlebsiellaPneumoniae,K.Pneumoniae)等细菌的生物膜均有不同程度的抑制作用。但目前还没有关于Nspd对真菌生物膜作用的相关研究报道。因此，本实验以口腔常见致病真菌，白色念珠菌（Candidaalbicans，C.albicans）作为实验对象。研究Nspd对C.albicans生物膜的作用和机制。本实验主要包括三个部分：前期研究为体外培养C.albicans，并确定最低杀真菌浓度（Minimumfungicidalconcentration，MFC）；第一部分为Nspd对C.albicans生物膜形成的作用和研究；第二部分为Nspd对已形成的C.albicans生物膜的作用和研究。
方法：
选取C.albicansSC5314为实验菌株进行体外培养，革兰氏染色后通过显微镜观察并鉴别。调节C.albicans浓度至1×106CFU/ml和梯度稀释后的Nspd共同培养建立体外培养生物膜模型进行研究。不包含Nspd的RPMI-1640（RoswellParkMemorialInstitute-1640）培养基组作为空白对照组、含有80μM的氟康唑（Fluconazole，FLC）培养基组作为氟康唑对照组、含有0.08%酒精培养基（氟康唑载体溶剂）组作为酒精对照组。
前期研究：选取－80℃冻存的C.albicans，室温下复苏并在沙氏葡萄糖液体培养基（SabouraudGlucoseLiquidMedium，SDB）液体培养基中进行体外培养，用于实验。使用RPMI-1640培养基对Nspd进行梯度稀释并与体外培养的5×103CFU/ml浓度的C.albicans在96孔板中共同培养，确定MFC。
第一部分实验：探讨Nspd对C.albicans生物膜形成的作用以及确定最低抑制生物膜浓度（Minimumbiofilminhibitoryconcentration，MBIC）。结晶紫染色法（Crystolviolet，CV）用于检测形成的生物膜的量、甲基四氮盐（XTTsodiumsalt，XTT）检测生物膜的代谢活性、通过菌落形成单位计数（Colony-FormingUnits，CFU）检测生物膜的生物量、在扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）下观察生物膜的量和真菌形态、实时定量核酸扩增（Real-timeQuantitativepolymerasechainreaction，qRT-PCR）检测毒力和真菌形态相关基因的表达水平。分别与对照组进行对比。
第二部分实验：将体外培养的液体C.albicans和RPMI-1640培养基在96孔板中共同培养使其在孔板底部形成C.albicans生物膜。使用RPMI-1640培养基对Nspd进行梯度稀释并转移到已形成生物膜的96孔板中继续培养。观察Nspd对已形成的C.albicans生物膜的作用，并确定最低生物膜清除浓度（Minimumbiofilmeliminationconcentration，MBEC）。使用第一部分实验相同方法检测生物膜的量、代谢活性、生物量、真菌形态、毒力和真菌形态相关基因表达水平，分别与对照组进行对比。
结果：
1.Nspd对C.albicans的MFC浓度均为55.9mM。
2.通过CV染色结果显示：不同浓度的Nspd对C.albicans生物膜形成具有不同程度的抑制作用，对已形成的C.albicans生物膜具有不同程度的清除作用。Nspd对C.albicans的MBIC浓度为111.7mM，与空白对照组吸光度值占比为5.1%；MBEC浓度为111.7mM,与空白对照组吸光度值占比为68.6%。
3.XTT生物膜代谢活性定量结果显示：不同浓度的Nspd对C.albicans生物膜代谢活性有不同程度的抑制作用。Nspd浓度为111.7mM时能有效降低C.albicans生物膜和已形成C.albicans生物膜的代谢活性，与空白对照组吸光度值占比分别为3.7%和5%。
4.CFU菌落计数结果显示：Nspd能有效杀灭C.albicans，浓度为111.7mM时能基本杀灭C.albicans，对已形成C.albicans生物膜，MBEC实验组生物量与对照组占比为33.6%。
5.从SEM的观察结果显示：Nspd浓度为111.7mM时基本没有C.albicans生物膜形成；能清除部分已形成的C.albicans生物膜，并且能改变C.albicans的生物形态。
6.qRT-PCR结果显示：Nspd能降低与C.albicans毒力和形态相关基因表达水平。
结论：
1.不同浓度的去甲亚精胺对白色念珠菌生物膜形成具有不同程度的抑制作用，对已形成的白色念珠菌生物膜具有不同程度的清除作用。
2.去甲亚精胺能降低白色念珠菌毒力相关基因的表达水平。
多胺（Polyamine）在原核生物和真核生物中普遍存在，是细胞生长所需的一种分子。研究表明，去甲亚精胺（Norspermidine，Nspd）作为多胺的一种，对于不同细菌生物膜起着不同的作用。Nspd最初被发现能促进霍乱弧菌（Vibriocholerae，V.cholerae）生物膜的形成。L.Hobley等人研究发现Nspd不仅能抑制枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis，B.subtilis)生物膜形成，对已形成的生物膜起到离散的作用。并且发现Nspd促进生物膜离散的作用位点为细胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）。后续不断有研究表明，Nspd对绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，S.epidermidis）、变异链球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,A.baumannii)、肺炎克雷伯氏菌(KlebsiellaPneumoniae,K.Pneumoniae)等细菌的生物膜均有不同程度的抑制作用。但目前还没有关于Nspd对真菌生物膜作用的相关研究报道。因此，本实验以口腔常见致病真菌，白色念珠菌（Candidaalbicans，C.albicans）作为实验对象。研究Nspd对C.albicans生物膜的作用和机制。本实验主要包括三个部分：前期研究为体外培养C.albicans，并确定最低杀真菌浓度（Minimumfungicidalconcentration，MFC）；第一部分为Nspd对C.albicans生物膜形成的作用和研究；第二部分为Nspd对已形成的C.albicans生物膜的作用和研究。
方法：
选取C.albicansSC5314为实验菌株进行体外培养，革兰氏染色后通过显微镜观察并鉴别。调节C.albicans浓度至1×106CFU/ml和梯度稀释后的Nspd共同培养建立体外培养生物膜模型进行研究。不包含Nspd的RPMI-1640（RoswellParkMemorialInstitute-1640）培养基组作为空白对照组、含有80μM的氟康唑（Fluconazole，FLC）培养基组作为氟康唑对照组、含有0.08%酒精培养基（氟康唑载体溶剂）组作为酒精对照组。
前期研究：选取－80℃冻存的C.albicans，室温下复苏并在沙氏葡萄糖液体培养基（SabouraudGlucoseLiquidMedium，SDB）液体培养基中进行体外培养，用于实验。使用RPMI-1640培养基对Nspd进行梯度稀释并与体外培养的5×103CFU/ml浓度的C.albicans在96孔板中共同培养，确定MFC。
第一部分实验：探讨Nspd对C.albicans生物膜形成的作用以及确定最低抑制生物膜浓度（Minimumbiofilminhibitoryconcentration，MBIC）。结晶紫染色法（Crystolviolet，CV）用于检测形成的生物膜的量、甲基四氮盐（XTTsodiumsalt，XTT）检测生物膜的代谢活性、通过菌落形成单位计数（Colony-FormingUnits，CFU）检测生物膜的生物量、在扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）下观察生物膜的量和真菌形态、实时定量核酸扩增（Real-timeQuantitativepolymerasechainreaction，qRT-PCR）检测毒力和真菌形态相关基因的表达水平。分别与对照组进行对比。
第二部分实验：将体外培养的液体C.albicans和RPMI-1640培养基在96孔板中共同培养使其在孔板底部形成C.albicans生物膜。使用RPMI-1640培养基对Nspd进行梯度稀释并转移到已形成生物膜的96孔板中继续培养。观察Nspd对已形成的C.albicans生物膜的作用，并确定最低生物膜清除浓度（Minimumbiofilmeliminationconcentration，MBEC）。使用第一部分实验相同方法检测生物膜的量、代谢活性、生物量、真菌形态、毒力和真菌形态相关基因表达水平，分别与对照组进行对比。
结果：
1.Nspd对C.albicans的MFC浓度均为55.9mM。
2.通过CV染色结果显示：不同浓度的Nspd对C.albicans生物膜形成具有不同程度的抑制作用，对已形成的C.albicans生物膜具有不同程度的清除作用。Nspd对C.albicans的MBIC浓度为111.7mM，与空白对照组吸光度值占比为5.1%；MBEC浓度为111.7mM,与空白对照组吸光度值占比为68.6%。
3.XTT生物膜代谢活性定量结果显示：不同浓度的Nspd对C.albicans生物膜代谢活性有不同程度的抑制作用。Nspd浓度为111.7mM时能有效降低C.albicans生物膜和已形成C.albicans生物膜的代谢活性，与空白对照组吸光度值占比分别为3.7%和5%。
4.CFU菌落计数结果显示：Nspd能有效杀灭C.albicans，浓度为111.7mM时能基本杀灭C.albicans，对已形成C.albicans生物膜，MBEC实验组生物量与对照组占比为33.6%。
5.从SEM的观察结果显示：Nspd浓度为111.7mM时基本没有C.albicans生物膜形成；能清除部分已形成的C.albicans生物膜，并且能改变C.albicans的生物形态。
6.qRT-PCR结果显示：Nspd能降低与C.albicans毒力和形态相关基因表达水平。
结论：
1.不同浓度的去甲亚精胺对白色念珠菌生物膜形成具有不同程度的抑制作用，对已形成的白色念珠菌生物膜具有不同程度的清除作用。
2.去甲亚精胺能降低白色念珠菌毒力相关基因的表达水平。