论文部分内容阅读
糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)是一种类固醇激素,其浓度受到下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenocoyical axis,HPA)轴的调控,在维持机体的稳态,调节生殖及免疫等功能中发挥了重要作用。促性腺激素释放激素(Gonadotropin-relesaing horme,GnRH)是一种10肽激素,是繁殖活动最重要的调节激素,主要通过下丘脑-垂体-性腺(Hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)轴来对生殖活动进行调控。在应激情况下,HPA轴主要通过分泌GC影响HPG轴,从而影响生殖,母畜的生殖能力会通过此种方式而下降。星形胶质细胞在整个中枢神经系统中占据重要地位,尤其在生殖、免疫、应激等方面。根据本实验室已完成的工作中,已经在体外证明了星形胶质细胞能够分泌GnRH,然而其受到哪种信号通路的调节仍然未知。GC-GCR是糖皮质激素发挥经典基因组效应的系统,P38 MAPK是与免疫相关的最重要信号通路。但其两者在星形胶质细胞分泌GnRH中发挥怎样的作用,未有相关资料报道。因此,在应激情况下星形胶质细胞分泌GnRH会发生怎样的变化,星形胶质细胞分泌GnRH会受到怎样的调节成为了本实验的研究重点。本实验利用体外培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞,探究P38 MAPK和GCR在糖皮质激素调节星形胶质细胞的GnRH表达中的作用,其中主要研究内容如下:(1)不同浓度GC对星形胶质细胞分泌GnRH的影响;(2)GCR在GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH中的作用;(3)P38 MAPK信号通路对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响;(4)P38 MAPK下游核转录因子NF-κB对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH的影响。(1)为了有效的探究P38 MAPK和GCR在糖皮质激素调节星形胶质细胞的GnRH表达中的作用,本实验采用1~3日龄的雌性SD新生大鼠,培养原代星形胶质细胞,经过原代培养、纯化和传代培养,获得所需细胞,经星形胶质细胞特异性标记蛋白-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色检验细胞,所得细胞的纯化率达99%以上,可进行后续实验。(2)为了研究不同浓度gc对星形胶质细胞分泌gnrh的影响,以糖皮质激素类似物地塞米松(dex)刺激星形胶质细胞,用10-4mol/l、10-5mol/l、10-6mol/l、10-7mol/l、10-8mol/l的dex分别处理1h、12h、24h、48h后,利用elisa检测不同浓度gc对星形胶质细胞gnrh的分泌情况、利用实时荧光定量pcr检测gnrh的mrna转录水平,并利用westernblot检测在各浓度gc处理下gcr的变化情况,结果显示,1h、12h、24h、48h时10-4mol/l、10-5mol/l、10-6mol/l、10-7mol/l、10-8mol/lgc处理组的蛋白及mrna转录水平均在不同阶段显著高于对照组(p<0.05),gcr在各时间段中对10-8mol/l浓度的gc最为敏感,综合分析确定10-8mol/l的gc为最佳的实验处理浓度。(3)为了研究gcr在gc刺激星形胶质细胞分泌gnrh中的作用,通过使用10-8mol/ldex-bsa与dex分别刺激星形胶质细胞,分别设置gc-bsa组、gc组和对照组,用免疫荧光方法检测gcr的激活情况,并利用elisa和实时荧光定量pcr方法对各组gnrh分泌量和mrna转录水平的变化进行检测,结果显示,gc组在1h、24h转录水平显著高于对照组(p<0.05),12h、24h的蛋白水平显著高于对照组证明(p<0.05),而gc-bsa组在各时间段与对照组相比无显著性差异,证明当gcr激活后能够促进糖皮质激素刺激星形胶质细胞gnrh的分泌。(4)为了研究p38mapk信号通路是否对gc刺激星形胶质细胞分泌gnrh具有调节作用,通过使用10μmol/l的p38阻断剂sb203580及10-8mol/ldex处理,分别设置p38阻断剂组、p38阻断剂+gc组、gc组与对照组,分别处理1h、12h、24h、48h后,检测各组gnrh分泌量、mrna水平的变化及gcr激活情况,结果显示在12h、24h时p38阻断剂+gc组与gc组的蛋白及转录水平均显著高于对照组(p<0.05),且p38阻断剂+gc组在mrna转录水平显著高于gc组(p<0.05),而在48h时p38阻断剂+gc组仍保持较高的分泌水平显著高于对照组(p<0.05),而p38阻断剂组的蛋白与转录水平在各时间段与对照组无显著性差异,综上所述表明,在gcr激活后,阻断p38mapk信号通路对gc刺激星形胶质细胞分泌gnrh具有上调作用。(5)为了研究p38mapk对激活下游核转录因子nf-κb的影响,通过使用10μmol/l的p38阻断剂sb203580及10-8mol/ldex处理,分别设置p38阻断剂组、p38阻断剂+gc组、gc组与对照组,分别处理1h、12h、24h、48h后,并通过westernblot检测不同时间nf-κb(p65)磷酸化情况。结果显示1h、12h时gc处理组的磷酸化p65表达量极显著高于对照组(p<0.01),24h时显著高于对照组(p<0.05);1h、12h时p38阻断剂组、p38阻断剂+gc组的磷酸化p65表达量极显著低于对照组(P<0.01),24 h时、P38阻断剂+GC组显著低于对照组(P<0.05);1 h、12 h时P38阻断剂组与P38阻断剂+GC组的磷酸化P65表达量无显著差异(P>0.05)。证明经GC处理后的星形胶质细胞的磷酸化P65表达量会增加,在加入P38阻断剂后的星形胶质细胞磷酸化P65表达量会降低,并且该过程不会受到GC的刺激而增加。综上可知,P38 MAPK是引起核转录因子NF-κB磷酸化的关键激酶。(6)为了研究P38 MAPK信号通路下游的NF-κB核转录因子是否对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有调节作用,通过使用10μmol/L NF-κB阻断剂BAY11-7082及10-8 mol/L DEX处理,分别设置NF-κB阻断剂组、NF-κB阻断剂+GC组、GC组与对照组,分别处理1 h、12 h、24 h、48 h后,检测各组GnRH分泌量、mRNA水平的变化及GCR信号通路激活情况,结果显示在12 h、24 h时NF-κB阻断剂+GC组、GC组的蛋白水平显著高于对照组(P<0.05),而NF-κB阻断剂+GC组在1 h、12 h、24 h、48 h极显著高于对照组与GC组(P<0.01)结果证明,在GCR激活后阻断P38 MAPK信号通路下游的核转录因子NF-κB对GC刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有上调作用。综上所述,该试验可以得到以下结果:1、糖皮质激素在10-8 mol/L至10-4 mol/L浓度范围内,均能促进星形胶质细胞中分泌GnRH,且糖皮质激素浓度越高这种促进分泌作用时间越长。2、糖皮质激素能够通过激活GCR促进星形胶质细胞分泌GnRH。3、当GCR激活后,阻断P38 MAPK-NF-κB信号通路及对糖皮质激素刺激星形胶质细胞分泌GnRH具有上调作用,即P38 MAPK-NF-κB信号通路对GCR在星形胶质细胞分泌GnRH的过程中具有抑制作用。4、GCR在糖皮质激素促进星形胶质细胞分泌GnRH中起到主导作用。