【摘 要】
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研究背景及意义:结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是引发人和动物结核病的病原体,巨噬细胞作为Mtb感染后主要的宿主细胞,可以通过自噬途径清除Mtb,限制其生长;而Mtb则会通过一些机制逃脱或抑制自噬。研究表明,长链非编码RNA(Longnon-coding RNA,LncRNAs)可在许多疾病过程中参与自噬的调节。其中,LncRNA-Cox2作为近年来受到
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研究背景及意义:结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是引发人和动物结核病的病原体,巨噬细胞作为Mtb感染后主要的宿主细胞,可以通过自噬途径清除Mtb,限制其生长;而Mtb则会通过一些机制逃脱或抑制自噬。研究表明,长链非编码RNA(Longnon-coding RNA,LncRNAs)可在许多疾病过程中参与自噬的调节。其中,LncRNA-Cox2作为近年来受到广泛关注的LncRNAs分子之一,有关其如何调控Mtb介导的巨噬细胞自噬的研究尚未见详细报道。因此探讨LncRNA-Cox2在巨噬细胞抵抗Mtb感染过程中对细胞自噬的调控作用具有重要的意义。目的与方法:本研究通过小干扰RNA(si-RNA)转染的方法构建了LncRNA-Cox2的干扰模型,并确定了si-RNA的转染效率和干扰效率。利用BCG(Bacillus Calmette-Guerin)诱导建立巨噬细胞感染模型研究干扰LncRNA-Cox2对巨噬细胞自噬过程的影响,随后分别从细胞形态学水平和细胞分子水平分析自噬流,探讨LncRNA-Cox2对BCG诱导小鼠巨噬细胞自噬的调控作用;并进一步用MHY1485(mTOR通路的特异性激动剂)来研究LncRNA-Cox2对自噬诱导环节的调控是否通过mTOR依赖性途径。实验结果如下:(1)BCG感染RAW264.7后,显著促进了 LncRNA-Cox2的表达。利用si-RNA成功建立LncRNA-Cox2干扰模型并初步检测自噬相关蛋白LC3 Ⅱ、LAMP2和Beclin1等的表达量。结果显示,干扰LncRNA-Cox2可促进LC3Ⅱ、LAMP2和Beclin1等蛋白的表达,且不影响巨噬细胞表面标志抗原F4/80的表达和细胞存活率。为后续探究LncRNA-Cox2在BCG诱导RAW264.7自噬中的调控作用提供良好的实验材料。(2)BCG感染RAW264.7后,干扰LncRNA-Cox2可促进自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Atg5、Atg12和Beclin1的表达,且胞内自噬体和自噬溶酶体数量均有所上调,自噬流增强。提示干扰LncRNA-Cox2可促进胞内自噬体形成,其可能在BCG感染诱导巨噬细胞RAW264.7自噬中发挥正调控作用。(3)BCG感染RAW264.7后,干扰LncRNA-Cox2抑制p-mTOR及其下游关键因子p-S6和p-ULK1的表达。显著下调p38-MAPK和p-PI3K的表达量,显著上调AMPK-α的表达量,而p-AKT和JNK没有发生显著的变化;用MHY1485激活mTOR信号传导,可抑制巨噬细胞自噬流水平,上调BCG感染的细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ和p-S6的表达,而Atg7显著下调,Beclin1和p62没有发生显著变化。以上结果说明LncRNA-Cox2对自噬的调控与mTOR依赖性途径有关。综上所述,在BCG感染诱导巨噬细胞的过程中,LncRNA-Cox2高表达以参与自噬过程的调节。干扰LncRNA-Cox2可通过抑制mTOR依赖性途径的磷酸化,降低mTOR信号转导通路活性,进而上调自噬相关调节因子的表达,促进自噬体形成。由此推测,下调的LncRNA-Cox2参与调控BCG诱导RAW264.7细胞自噬可能是通过抑制mTOR信号传导通路,上调LC3Ⅱ表达,促进自噬体形成,进而在自噬过程中发挥正调控作用。
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