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近些年研究证实，ESX-1蛋白分泌系统与结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活、生长繁殖及致病密切相关，是结核分枝杆菌的一个重要毒力因子。现已确认，ESX-1系统可分泌多个结核分枝杆菌蛋白，这些分泌蛋白存在共分泌现象，缺失其中某种蛋白就会影响其他蛋白的分泌，同时导致结核分枝杆菌毒力及致病性的显著下降，因此通过基因敲除和过表达去单独研究某一种ESX-1分泌蛋白功能比较困难。目前，对于每一种ESX-1蛋白是否直接参与了结核分枝杆菌的致病过程以及参与致病的分子机理是什么还不太清楚或存在不同的观点。本文主要以两个ESX-1分泌蛋白ESAT-6和EspB为研究对象，以建立稳转细胞系和重组BCG为主要手段，来考察这两个蛋白对巨噬细胞吞噬功能、细胞凋亡和吞噬体成熟的影响，分析其调控机理，探讨它们在结核分枝杆菌致病过程中的地位和所起的作用，从而加深对ESX-1分泌系统致病机理的了解，为研制结核病治疗药物和新型疫苗提供新的靶点。首先，构建了稳定表达ESAT-6和EspB的系列小鼠巨噬细胞系。国外研究显示，EspB在从结核分枝杆菌分泌到菌体外过程中，会被周质腔MycP1酶裂解，只有其N端（EspBN）会分泌至菌体外，可能与巨噬细胞相互作用。前期研究中，我们曾分别建立与绿色荧光蛋白EGFP融合表达的ESAT-6和EspB稳转细胞系RAW-E6和RAW-EspB。本研究以表达EGFP-EspB融合蛋白的质粒为模板，通过反向PCR技术，构建了表达EGFP-EspBN融合蛋白的pEGFP-EspBN重组质粒。利用脂质体介导的方法，把该重组质粒转染至小鼠RAW264.7细胞系中，经G418筛选，及在基因水平、转录水平和蛋白表达水平鉴定，获得了稳定表达EGFP-EspBN的RAW-EspBN巨噬细胞系。考虑到EGFP是一个分子量较大的蛋白，与其融合表达会否影响ESAT-6和EspB的结构与功能还不清楚，所以我们又构建了小分子量标签flag与ESAT-6和EspBN融合表达的巨噬细胞系。在原有表达质粒基础上，通过反向PCR技术，构建了重组表达质粒pFLAG-ESAT-6、pFLAG-EspBN和pFLAG-EGFP，经细胞转染、筛选与鉴定，获得了稳定表达flag-ESAT-6、flag-EspBN和flag-EGFP融合蛋白的巨噬细胞系RAW-flag-E6、RAW-flag-EspBN和RAW-flag-EGFP。通过western blot分析了稳转细胞系中目标蛋白表达定位情况，发现EGFP-EspBN和flag-EspBN在细胞质和细胞膜上均有分布，flag-ESAT-6与flag-EGFP主要表达于RAW264.7细胞质中。这一系列细胞系的建立为研究ESAT-6和EspB对巨噬细胞功能的调控作用，以及它们与巨噬细胞相互作用的分子机理提供了研究工具。其次，构建了表达ESAT-6和EspB的系列重组BCG。BCG是减毒的牛分枝杆菌，是唯一上市的结核疫苗，其基因组中没有RD-1区，不能表达ESAT-6，虽能表达EspB但不能分泌。因此，为排除ESX-1共分泌系统其他蛋白的干扰，我们研究ESAT-6与EspB生物功能的另外一个策略就是构建分泌表达ESAT-6和EspBN的重组BCG（rBCG）。将ESAT-6基因与sESAT-6基因（带Ag85B信号肽序列）分别克隆进穿梭质粒pLYG206中，构建了表达质粒pLYG-ESAT-6和pLYG-SESAT-6。通过电转化的方法，把这两个表达载体分别转入BCG，经zeocin抗生素筛选，菌落PCR鉴定与western blot分析，分别获得胞内表达ESAT-6的rBCG-E6和分泌表达ESAT-6的rBCG-SE6。将EspB与EspBN基因克隆进pLYG206，构建了表达质粒pLYG-EspB和pLYG-EspBN。通过转化、筛选与鉴定，分别获得表达EspB的rBCG-EB和表达EspBN的rBCG-EN。进一步分析发现，rBCG-EN能够以一种未知的方式分泌表达EspBN至菌体外，而rBCG-EB只能够在细胞内表达EspB。系列重组BCG的获得为建立结核分枝杆菌的感染模型，探讨ESX-1分泌蛋白对巨噬细胞的调控作用，以及构建新型疫苗提供了基础。研究了ESAT-6对巨噬细胞吞噬功能的影响。吞噬功能是巨噬细胞对抗病原入侵的早期防御性反应，而ESAT-6作为结核分枝杆菌早期分泌的毒力蛋白已被证实通过多种途径调控巨噬细胞功能。因此我们推测ESAT-6可能也会影响巨噬细胞的吞噬功能，并分别以稳转巨噬细胞系、重组蛋白处理巨噬细胞和重组BCG感染巨噬细胞三种方式考察了ESAT-6对巨噬细胞吞噬功能的影响。一、通过流式细胞仪、共聚焦显微镜和菌落计数等方法分析显示，稳转细胞系RAW-E6（表达EGFP-ESAT-6融合蛋白）和RAW-flag-E6（表达flag-ESAT-6融合蛋白）吞噬荧光微球及E.coli的能力明显增强。二、经流式细胞仪分析，重组ESAT-6蛋白处理的RAW264.7细胞显示出吞噬荧光微球的能力增强。三、类似方法分析显示，rBCG-SE6感染RAW264.7细胞可增强巨噬细胞的吞噬功能，而rBCG-E6对吞噬功能无显著影响。这些结果均说明了ESAT-6能够增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能。进一步，我们对可能增强巨噬细胞吞噬功能的因素p38、IL-12和ESAT-6膜穿孔作用进行了考察，结果显示ESAT-6增强巨噬细胞吞噬功能不依赖于p38途径和细胞因子IL-12，而是可能与ESAT-6的膜穿孔作用有关。研究了ESAT-6对巨噬细胞凋亡的影响。许多研究报道，结核分枝杆菌能够诱导巨噬细胞以及上皮细胞的凋亡，但其诱导巨噬细胞凋亡的成分和对诱导凋亡机理的解释各不相同。为了解ESAT-6在这一过程中的作用及探讨可能的分子机理，本研究通过流式细胞术分别考察了稳转巨噬细胞系、重组蛋白处理的巨噬细胞和重组BCG感染的巨噬细胞的凋亡情况。一、发现RAW-E6只有在培养48h后才能够表现出显著的细胞凋亡增强，培养24h时无此现象；RAW-flag-E6在培养48h后也表现出显著的细胞凋亡增强，此时细胞内flag-ESAT-6融合蛋白浓度大约500ng/mL。二、发现10μg/mL的rESAT-6能够诱导巨噬细胞凋亡，而5μg/mL的rESAT-6对巨噬细胞凋亡无明显诱导作用。这些数据说明ESAT-6诱导细胞凋亡具有剂量依赖性，且细胞内ESAT-6在较低浓度就可诱导巨噬细胞凋亡。三、发现在连续感染RAW264.7细胞3天时，rBCG-SE6感染组与BCG感染组、rBCG-E6感染组之间无显著统计学差异，但是可以观察到rBCG-SE6感染的巨噬细胞随时间有细胞凋亡增强的趋势。进一步分析显示，RAW-E6和RAW-flag-E6的caspase-3活性均显著升高。这些数据表明结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6在细胞内低水平表达就可依赖caspase-3信号通路诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡。研究了EspB对巨噬细胞吞噬体成熟的影响。有证据显示，ESX-1分泌蛋白中除CFP-10和ESAT-6以外的某个蛋白对抑制吞噬体的成熟是必需的，我们推测EspB很可能就是这个关键分子。通过共聚焦显微镜观察和E.coli的存活菌落数检测，我们分别对稳转EspBN的巨噬细胞系和重组BCG感染巨噬细胞的吞噬体成熟进行了分析。一、RAW-EspBN细胞系和RAW-flag-EspBN细胞系的溶酶体与吞噬体的共定位率明显的降低；RAW-flag-EspBN细胞吞噬的E.coli存活率显著高于野生型RAW264.7细胞和对照RAW-EGFP细胞。二、rBCG-EspBN显著地抑制了RAW-flag-E6细胞内吞噬体成熟；但是对RAW264.7细胞则无显著抑制吞噬体成熟作用。根据上述结果，我们推测EspB的N端（即EspBN）在细胞质中可抑制巨噬细胞吞噬体成熟，但在结核杆菌感染过程中需要ESAT-6的协助，即ESAT-6在吞噬体膜上穿孔帮助EspBN进入细胞质发挥作用。综上所述，本研究成功建立了稳定表达ESAT-6和EspB的系列巨噬细胞系，构建了过表达ESAT-6和EspB的系列重组BCG菌株，为研究两个蛋白对巨噬细胞功能的调控作用，以及它们与巨噬细胞相互作用的分子机理提供了工具。研究发现ESAT-6在细胞内可显著增强巨噬细胞的吞噬功能，这可能与ESAT-6的细胞膜穿孔作用相关；细胞内低水平表达的ESAT-6还可以诱导巨噬细胞的凋亡，这种作用依赖caspase-3途径得以实现；EspB通过其N端可抑制巨噬细胞吞噬体成熟，可能对结核分枝杆菌在巨噬细胞内存活起到重要作用，这种功能的发挥依赖于ESAT-6的协同作用。