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目的:研究TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor,TRAF6)对髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)免疫抑制功能的调控,并探讨其潜在的分子机制,为靶向MDSCs的肿瘤免疫治疗提供新思路。方法:(1)采用免疫磁珠法分选野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏来源CD11b~+Gr1~+MDSCs,流式细胞仪分选荷瘤小鼠肿瘤组织来源CD11b~+Gr1~+MDSCs,流式细胞术(FCM)鉴定细胞纯度。利用qRT-PCR和Western-blot检测野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏、肿瘤组织来源MDSCs中TRAF6的表达情况。(2)采用CFSE染色法检测CD4~+T细胞的增殖能力,比较荷瘤小鼠脾脏、肿瘤组织来源MDSCs对CD4~+T细胞增殖的抑制作用。采用qRT-PCR检测MDSCs抑制性效应分子精氨酸酶1(Arg1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达水平。(3)为了探究TRAF6对MDSCs的免疫抑制功能是否具有调控作用,采用小鼠TRAF6特异性siRNA敲减肿瘤组织来源MDSCs中的TRAF6后,检测MDSCs免疫抑制功能的改变。包括将转染control siRNA(siNC)、转染TRAF6 siRNA(siTRAF6)的MDSCs与CD4~+T细胞共培养,CFSE染色法检测CD4~+T细胞的增殖能力,从而反映MDSCs的免疫抑制功能;同时,使用siTRAF6敲减MDSCs中的TRAF6后,比色法检测MDSCs效应分子Arg1活性以及Griess法检测效应分子NO含量的变化。(4)采用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测肿瘤组织来源MDSCs中TRAF6与STAT3是否相互结合。采用小鼠TRAF6特异性siRNA敲减肿瘤组织来源MDSCs中的TRAF6后,Co-IP与Western-blot检测MDSCs中STAT3的K63位多聚泛素化及STAT3的磷酸化水平。(5)为了体内探究TRAF6对MDSCs免疫抑制功能的影响,我们将野生型C57BL/6小鼠分为对照组和siTRAF6-MDSCs组,对照组小鼠皮下注射1×10~6转染siNC的MDSCs和1×10~6Lewis的细胞混合液,siTRAF6-MDSCs组小鼠皮下注射1×10~6转染siTRAF6的MDSCs和1×10~6 Lewis的细胞混合液。观察肿瘤的生长进程。种植细胞后第28天处死小鼠,剥离肿瘤结节并称重;FCM检测荷瘤小鼠引流淋巴结、脾脏和肿瘤组织中CD3~+CD4~+IFN-γ~+T细胞(Th1)和CD3~+CD8~+IFN-γ~+T细胞(CTL)的比例。结果:(1)小鼠脾脏和肿瘤组织来源的MDSCs纯度均达95%以上。与野生型小鼠脾脏、荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs相比,荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中TRAF6的mRNA水平和蛋白水平显著升高(p<0.05)。(2)荷瘤小鼠脾脏、肿瘤组织来源MDSCs分别与CD4~+T细胞共培养,与荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs相比,肿瘤组织来源MDSCs对CD4~+T细胞增殖的抑制作用更强;并且与荷瘤小鼠脾脏来源MDSCs相比,肿瘤组织来源MDSCs的抑制性效应分子Arg1和iNOS表达水平更高(p<0.05)。表明荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs比脾脏来源MDSCs具有更强的免疫抑制功能。(3)转染siTRAF6的肿瘤组织来源MDSCs与CD4~+T细胞共培养,CD4~+T细胞的增殖能力高于转染对照组,表明敲减MDSCs中的TRAF6后,MDSCs对CD4~+T细胞增殖的抑制作用明显减弱。此外,敲减TRAF6后MDSCs的抑制性效应分子Arg1的活性降低(p<0.05),但NO的含量无明显改变。(4)肿瘤组织来源MDSCs中TRAF6与STAT3相互结合。抑制肿瘤组织来源MDSCs中TRAF6的表达后,STAT3的K63位多聚泛素化水平显著下降。此外,敲减肿瘤组织来源MDSCs中的TRAF6后,STAT3的磷酸化水平明显降低。(5)与对照组相比,注射转染siTRAF6的MDSCs和Lewis细胞组的小鼠(siTRAF6-MDSCs组)肿瘤的发展进程明显延缓,肿瘤的体积和重量都显著减小(p<0.05)。对照组荷瘤小鼠引流淋巴结中Th1细胞的比例为3.63±0.23%,siTRAF6-MDSCs组荷瘤小鼠引流淋巴结中Th1细胞的比例为5.82±0.69%,与对照组相比,siTRAF6-MDSCs组荷瘤小鼠引流淋巴结中Th1细胞的比例明显升高(p<0.05)。对照组荷瘤小鼠肿瘤组织中CTL细胞的比例为2.47±0.35%,siTRAF6-MDSCs组荷瘤小鼠肿瘤组织中CTL细胞的比例为3.93±0.34%,与对照组相比,siTRAF6-MDSCs组荷瘤小鼠肿瘤组织中CTL细胞的比例显著上调(p<0.05)。结论:TRAF6在荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中高表达。TRAF6通过介导STAT3的K63位多聚泛素化,调控MDSCs的免疫抑制功能。