构建hCGD肿瘤基因疫苗的真核表达载体TR421-ehCGβ,可以在小鼠体内诱生较强的特异性针对hCGβ的体液免疫反应,我们发现由该基因疫苗诱导的多克隆抗hCGβ血清可以在体外以补体非依赖的方式抑制王-IeLa、HepG2等肿瘤细胞的增殖,并且抗hCGβ抗体的抗增殖活性与肿瘤细胞表达hCGβ的高低密切相关。为了进一步研究抗hCGβ抗体对肿瘤细胞生物学功能的影响,本课题利用TR421-hCGβ通过基因免疫手段免疫小鼠制备抗hCGβ单克隆抗体,鉴定其生物学特性,并从中筛选具有抗肿瘤活性的单克隆抗体,分析其抗瘤效应,为基于hCGβ的肿瘤生物治疗寻找新的途径。　　 第一部分 基于基因免疫抗hcGβ单克隆抗体的制备　　 一、TR421-hCGβ基因免疫小鼠诱导产生特异性体液免疫应答　　 为制备抗hCGβ单克隆抗体,以TR421-0hCGβ经肌肉免疫BALB/c小鼠。采血收集血清,检测各组小鼠血清中抗hCGβ抗体,结果显示:DNA初次免疫后第10天即可检测出抗hCGβ特异性抗体,追加免疫后抗体的水平显著增高,特异性IgG滴度达1:104,在初次免疫后第4周再次增强免疫,抗体水平继续升高,而且各免疫小鼠的抗体上升水平趋向一致,以上结果提示TR421-hCGβ基因免疫小鼠可诱生特异性体液免疫应答。为下一步成功高效的进行免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合奠定了基础。　　 二、特异性分泌抗hCGβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立　　 为获得特异性分泌抗hCGβ单克隆抗体的杂交瘤细胞,取抗体效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,在8块96孔板中,共有340孔可见明显杂交瘤细胞生长,融合率为45％。随后,对已融合的杂交瘤细胞进一步检测其是否分泌特异性抗hCGβ抗体,ELISA结果显示:1A11、2E9、2G7、2H3、3C2、3F2、4C6、4G7、5C5、5D5、6H1、7A3、7A8、8D4、8F1初步检测到有特应性抗体产生。对筛选阳性孔进行有限稀释法克隆和上清筛选,经过三次亚克隆,共获得9株分泌特异性抗hCGβ单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1A11、2E9、2G7、3C2、5C6、5D5、6H1、7A8和8F1。染色体核型分析显示所有获得的杂交瘤细胞株染色体数目均在90条以上,将杂交瘤细胞经体外连续传代培养,液氮冻存半年后复苏,仍生长良好,持续稳定分泌抗体,证明9株杂交瘤细胞株已成功建立。　　 三、抗hCGβ单克隆抗体的基本生物学特性鉴定　　 为证明所获得的单克隆抗体可以特异性识别hCGβ分子,用免疫印迹法(Westernblot)鉴定抗体与hCGβ分子的特异性结合,结果显示:9株单克隆抗体印染的PVDF膜在hCGβ的位置上出现了特异性的染色条带,大小为30kD左右,与文献报道的人hCGβ分子量相符合,证实获得的单克隆抗体均可以特异性识别真核细胞表达的hCGβ蛋白。应用间接免疫荧光证实,9株单克隆抗体可以不同程度识别HeLa细胞、HepG2细胞和HL60细胞上表达的膜型hCGβ分子。同时应用间接ELISA确定其亚型,1A11、2E9、5D5和7A8亚型为IgG1,2G7、3C2和6H1亚型为IgG2a,5C6和8目的亚型为IgG2b。　　 第二部分 具有抗肿瘤活性的抗hCGβ单克隆抗体的筛选　　 一、具有抗肿瘤细胞增殖活性的抗hCGβ单克隆抗体的筛选　　 在筛选具有抗肿瘤细胞增殖活性的单克隆抗体之前,我们对本实验中通过基因免疫获得的多克隆抗血清进行了功能鉴定。肿瘤细胞体外增殖结果显示:TR421-hCGβ质粒免疫血清(1:10稀释)相对于正常血清对HeLa细胞和HepG2细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。灭活补体后的免疫血清对细胞增殖的仍然有较显著的抑制作用,提示:抗hCGβ多克隆抗体对hCGβ阳性肿瘤细胞具有明显抑制作用,且该作用不依赖补体。为检测第一部分中制备的抗hCGβ单克隆抗体是否同样抑制肿瘤细胞的体外增殖活性,我们通过检测杂交瘤细胞的培养上对HeLa细胞增殖的影响,发现:6H1杂交瘤细胞培养上清与HeLa细胞共孵育48小时后,抗体处理组活细胞数占未处理组细胞数的81.67±7.63％,提示6H1能够抑制体外培养的HeLa细胞的增殖。　　 二、6H1单克隆抗体的制备纯化及基本特性鉴定　　 为进一步对6H1单克隆抗体的抗肿瘤效应进行分析,我们采用体内法收集小鼠腹水,制备高效价高纯度的6H1单克隆抗体,腹水产生的阳性率为80％,收获量平均5ml/只,腹水抗体效价达1:106。腹水经预处理后经Protein G亲和层析柱纯化,用SDS-PAGE电泳鉴定纯度达到90％以上。ELISA鉴定纯化6H1单克隆抗体可以特异性的结合hCG,同时与hLH或FSH无交叉反应性。FACS检测结果显示:7株肿瘤细胞表达的膜结合型hCG可以不同程度的被纯化6H1单抗识别并结合。间接免疫荧光染色进一步证实,6H1单抗能够特异性的识别HeLa细胞表达的具有天然构象的膜型hCGβ分子。　　 第三部分 6H1单克隆抗体的抗肿瘤作用及其机制　　 一、6H1在体外抑制肿瘤细胞增殖　　 为观察纯化的抗hCGβ单克隆抗体6H1对肿瘤细胞增殖活性的影响,选择天然高表达hCGβ的人HeLa细胞作为靶细胞,检测纯化6H1抗体孵育细胞的增殖活性。结果证实,6H1与HeLa细胞共孵育后显示有明显的细胞毒作用,并且呈剂量依赖性,当6H1以浓度160μg/ml作用时,HeLa细胞生长抑制率达58％。随着孵育时间的延长,6H1对细胞生长的抑制效应也趋明显,呈时间依赖性。为进一步观察纯化的抗hCGp单克隆抗体6Hl对其他表达hCGβ的肿瘤细胞增殖活性的影响,选择其他表达hCGβ的人肿瘤细胞系HL-60、K562、HepG2、7721、PC-3以及SKOV-3作为靶细胞,以不表达hCGβ的ECV-304细胞为对照,检测纯化6H1抗体孵育细胞的增殖活性。结果显示,除HeLa细胞外,HL-60、HepG2、7721和PC-3不同程度的对6H1单克隆抗体的细胞毒作用敏感,而K562和SKOV-3细胞活度没有明显变化。　　 二、6H1在体内抑制肿瘤生长　　 为进一步验证6Hl单克隆抗体对HeLa细胞存在细胞毒作用,我们进行裸鼠体内肿瘤攻击实验。将裸鼠皮下种植HeLa细胞肿瘤后进行抗体干预,每周测量肿瘤大小及并记录荷瘤小鼠的生存周期的变化。结果显示:荷瘤后第28天,6H1处理组肿瘤平均体积为1.76cm3,分别与对照抗体处理组3.41cm3、PBS处理组3.63cm3相比,差异有统计学意义(p<0.01)。同时监测荷瘤小鼠的生存周期,PBS对照、对照抗体处理小鼠的平均生存期分别为30和37天,而6H1处理组的小鼠直至第48天,仍有100％的存活率,小鼠平均生存期为77天。证明6H1单克隆抗体可以抑制体内HeLa细胞的生长。　　 三、6H1单克隆抗体诱导肿瘤细胞凋亡　　 为探讨6H1单克隆抗体对肿瘤细胞增殖的抑制效应的作用机制,相差显微镜下观察6H1孵育48h的HeLa细胞形态,结果发现,与6H1抗体共孵育的HeLa细胞与对照相比,部分细胞体积变小,表面无光泽,变圆,细胞表面突起多个小球状的凋亡小体,提示:6H1能诱发hCGβ阳性肿瘤细胞活力下降甚至凋亡,hCGβ阳性肿瘤细胞增殖活性下降可能与其有关。Hoechst 33258染色试验进一步从形态学上提示:6H1单克隆抗体可以诱导HeLa凋亡。收集6H1作用的HeLa细胞,抽取细胞总DNA进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示:与正常对照组细胞基因组DNA相比,6H1作用的HeLa细胞DNA呈明显的ladder,提示有凋亡细胞的存在。对6H1处理的HeLa细胞进行Annexin V/PI双染,FACS检测结果显示:6H1单克隆抗体作用48小时后,显示早期凋亡信号(Annexin V+/PI-)的HeLa细胞数量(9.46％)明显多于对照抗体组(0.80％),晚期凋亡细胞(Annexin V+/PI+)数量(4.55％)也明显多于对照组(0.71％),坏死细胞(Annexin V+/PI+)数量也较对照组有部分增加。说明6H1单克隆抗体可以通过引起肿瘤细胞凋亡介导其抗肿瘤作用。　　 综上所述,本课题基于基因免疫原理,运用经典的B细胞杂交瘤技术,获得了9株持续稳定分泌特异性抗hCGβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,这些单克隆抗体可以特异性结合肿瘤细胞表达的hCGβ分子。通过对这些单克隆抗体进行生物学功能的筛选,我们发现6H1单克隆抗体可以在体外抑制HeLa细胞的增殖,通过进一步的实验证明,6H1对hCGβ阳性的肿瘤细胞株有比较显著的细胞毒作用,并具有体内抑瘤活性。通过对凋亡相关指标的监测,我们证明6H1可以通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥其体内外抗肿瘤效应。本研究为今后hCGβ表达阳性的肿瘤的防治提供了新的途径,并可进一步对这株抗体进行人源化改造,因而具有潜在的实用价值；同时,本研究提示肿瘤表达hCGβ分子可能与肿瘤的增殖或抗凋亡特性相关,也为深入研究肿瘤异位表达的hCGβ与肿瘤生物学特性之间的关系提供了新的思路。