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研究背景放疗作为重要的治疗方法之一,主要用于多种恶性肿瘤细胞的杀伤。但其在发挥治疗作用的同时也不可避免地杀伤一些正常细胞,成为限制其临床应用的最重要原因。越来越多的研究发现,辐射除了杀伤分裂旺盛的细胞,还能导致多种免疫细胞显著减少以及促炎因子释放,从而影响受损细胞和组织的修复,抑制免疫甚至引发全身反应综合征。巨噬细胞广泛地分布于全身各种组织和器官中,在调节细胞功能,促进炎症消退,修复损伤组织的过程中发挥重要作用。巨噬细胞作为固有免疫系统中响应辐射损伤最早的细胞类型,在辐射损伤的早期和晚期均观察到巨噬细胞募集、活化、转化并促进损伤组织修复的证据。巨噬细胞受损会严重阻碍机体暴露辐射后炎症的消退和损伤组织的修复。研究发现,NLRP3炎症小体活化介导的细胞焦亡是巨噬细胞在病毒感染、热应激损伤和鞭毛蛋白等多种刺激条件下的重要死亡方式。并且有研究发现辐射可以诱导肺组织和口腔黏膜等多种组织NLRP3炎症小体活化从而介导细胞和组织损伤。因此,探索NLRP3炎症小体活化介导的细胞焦亡在辐射诱导的巨噬细胞死亡中的作用可能为减轻放疗毒副作用,提高治疗效果提供新的策略。研究目的本课题组拟在体内和体外水平研究辐射对巨噬细胞NLRP3炎症小体和细胞焦亡的作用,并利用Nlrp3敲除小鼠阐明NLRP3炎症小体在辐射诱导巨噬细胞焦亡中的作用机制。研究方法分离培养骨髓巨噬细胞,采用CCK-8试剂盒、焦亡检测试剂盒、LDH活性检测试剂盒和各种炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-18、IFN-γ、IL-1α、IL-6、MCP-1及IL-12p40)ELISA检测试剂盒检测辐射后巨噬细胞的存活情况、细胞焦亡比例以及分泌炎性因子的情况。利用RT-PCR和Western Blot分析辐射对巨噬细胞NLRP3炎症小体的影响。分离培养WT型和Nlrp3敲除骨髓巨噬细胞,检测辐射后巨噬细胞的存活情况、细胞焦亡比例及NLRP3炎症小体活化相关蛋白表达水平,研究NLRP3炎症小体在辐射诱导的巨噬细胞焦亡中的作用。体内实验利用免疫荧光和Western Blot分析辐射后WT小鼠和Nlrp3敲除小鼠脾脏NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平,验证辐射对NLRP3炎症小体的作用。采用透视电镜观察辐射后两种基因型小鼠脾脏巨噬细胞形态,研究接受辐射后巨噬细胞的损伤方式。通过绘制两基因型小鼠接受辐射后的生存曲线研究Nlrp3敲除对辐射导致小鼠死亡的整体性保护作用。研究结果一、辐射诱导骨髓巨噬细胞炎症小体活化和焦亡CCK-8检测发现辐射后骨髓巨噬细胞存活率下降,并呈剂量和时间依赖性。FAMYVAD-FMK和PI标记辐射后骨髓巨噬细胞,显示双阳性细胞比例以及培养上清LDH活性增加,并呈剂量依赖性。ELISA检测细胞上清炎性因子发现10 Gy和20 Gy辐射后,M1型巨噬细胞相关炎性因子(TNF-α、IFN-γ和IL-12)、炎症小体活化相关炎性因子(IL-1β和IL-18)以及其他炎性因子(IL-1α和MCP-1)升高。然而,5 Gy辐射后细胞上清中IL-1β、IL-18和IFN-γ含量增加,但TNF-α、IL-12p40、IL-1α和MCP-1含量无明显变化。此外,骨髓巨噬细胞高剂量辐射(10 Gy和20 Gy)后cleaved-Caspase-1(p10)产生增多,而低剂量辐射(5 Gy)组cleaved-Caspase-1(p10)较对照组无明显变化。二、Nlrp3敲除显著抑制辐射诱导的骨髓巨噬细胞炎症小体活化和焦亡Nlrp3敲除后10 Gy辐射诱导的骨髓巨噬细胞死亡比例从25.98%下降到5.45%,并且10 Gy辐射诱导的骨髓巨噬细胞cleaved-Caspase-1(p10)和IL-1β产生显著减少。此外,Nlrp3敲除后10 Gy辐射诱导的FAM-YVAD-FMK和PI双染的骨髓巨噬细胞比例以及LDH活性显著下降,三、Nlrp3敲除对辐射诱导的损伤具有保护作用9.5 Gy辐射后小鼠脾脏cleaved-Caspase-1(p10)产生增多,血清IL-1β水平增高。Nlrp3敲除辐射(9.5 Gy)组小鼠脾脏cleaved-Caspase-1(p10)产生和血清IL-1β水平较对照组增高不明显。免疫荧光染色显示9.5 Gy辐射后小鼠脾脏cleaved-Caspase-1(p10)产生增多并且主要表达于脾脏边缘区细胞(富含巨噬细胞),Nlrp3敲除辐射组小鼠脾脏边缘区细胞cleaved-Caspase-1(p10)表达与对照组差别不明显。电镜结果显示9.5 Gy辐射后,WT小鼠脾脏巨噬细胞表现出焦亡样改变(细胞发生肿胀,细胞表面形成小的空泡并脱落到细胞间隙内,细胞核未见明显的固缩、破裂或溶解),而Nlrp3敲除辐射(9.5 Gy)组小鼠脾脏巨噬细胞未见明显变化。此外,生存分析显示,Nlrp3敲除辐射(9.5 Gy)组小鼠生存率和生存时间显著高于WT辐射组小鼠。结论低剂量辐射可以诱导巨噬细胞分泌多种炎性因子,高剂量辐射不仅可以促进巨噬细胞分泌炎性因子,还可以通过活化NLRP3炎症小体介导巨噬细胞焦亡。靶向抑制NLRP3炎症小体活化及继发的巨噬细胞焦亡,可作为限制辐射诱导的巨噬细胞损伤、促炎反应爆发和相关组织损伤的一个重要策略。