本文立足于TLR、RIG干扰素信号通路,研究了该信号通路中有关蛋白的结构与功能,以及它们在病毒刺激中的应答,同时,本文还选取了SKIV(Spottedknife iridovirus)病毒的一个基因-FLP(Ftsk Like Protein),作为研究该病毒致病、染色体复制与包装的出发点。　　 (1)在TLR信号通路中,IRF5/7(Interferon Regulatory Factor5/7)在其中具有重要的意义,通过生物信息学分析,发现斑马鱼的IRF7蛋白与人类IRF7蛋白的同源度很低,通过RACE技术,对斑马鱼zfIRF5/7二个基因进行了克隆。zfIRF7编码423个氨基酸,QRT-PCR表明其mRNA表达在脑,心脏含量比较高,而zfIRF5编码297个氨基酸,组织表达具有广谱性,这2个基因在胚胎发育6hpi时mRNA相对含量较高,随着胚胎的发育成熟而慢慢降低,最后趋于稳定。将zfIRF7的荧光表达载体进行斑马鱼胚胎显微注射实验,没有发现斑马鱼在胚胎发育中有畸形。zfIRF5继哺乳动物中已经发现的9种IRF5剪接体后的又一种新发现的IRF5剪接体分子,它作为zfIRF5全长的一部分,只具有N端的IRF结构域,而缺失C端IRF3结构域。在L8G5-LUC荧光素酶报告基因活性分析实验中,zfIRF5与zfIRF7一样可以激活基因的转录,而且C端比全长还要强1.5倍。IRF5/7可以激活ISRE信号通路,但是IRF7可以激活INF-β信号通路而zfIRF5没影响,同时zfIRF7在ISRE,INF-β的这种激活活性可以被zfIRF5所抑制。在荧光共定位实验中,zfIRF7可以促进zfIRF5定位在细胞核,为IRF5蛋白的入核提供了一个全新的佐证。通过CO-IP实验,确定zfIRF5可以与zfIRF7相互作用。斑马鱼在POLY(I:C)、LPS的刺激后,zfIRF7基因在12小时表达开始上升,但是zfIRF5对此并不敏感。ISKNV(Infectious spleen and kidney necrosis virus)感染斑马鱼后、zfIRF7在感染48后表达开始急剧上升,zfIRF5的变化不明显。诱导表达和纯化了zfIRF5/7的融合蛋白,并获得了相应的兔源多克隆抗体,为将来的功能研究奠定基础。　　 (2)MAVS(mitochondrial anti-viral signaling protein)是RIG信号通路中重要蛋白,在NCBI河鲀的数据库中,我们发现了一个类似MAVS的蛋白的分子,利用已知的染色体DNA片段序列,对该基因进行了5、3RACE,得到了2630bp的该基因全长序列,其ORF全长1656bp,编码551个氨基酸,利用该ORF片段,构建了系列载体,对它们进行了系列的功能研究。在生物信息学分析表明,MAVS-like含有一个CARD、一个PRO-rich、三个GLA-rich和一个TM跨膜结构域,这些特征是已知的MAVS所相似的。我们对河纯MAVS-like基因的组织分布做了定量分析,MAVS-like在肝脏,肌肉中含量很高。利用LPS、PGN、poly(I:C)对河纯进行刺激时,发现MAVS-like的mRNA水平对LPS、PGN的刺激不敏感,在poly(I:C)的刺激下急剧下降,当ISKNV感染河鲀时,MAVS—like的mRNA水平也下调。通过ISRE,NF-κB信号通路的信号传导实验,表明MAVS-like可以激活这两条信号通路,MAVS-like缺失PRO-RICH domain后,信号强度明显增强,当该基因缺少TM区域时,则抑制信号的传导的:在荧光定位实验中,MAVS-like无法定位在线粒体,而是定位在细胞膜的附近,这与编码ORF的第1,2和4号外显子有关系,当1,2号外显子一起缺少,或者4号外显子缺失,该突变体都不象全长一样定位在细胞膜附近,但是缺失TM区域,对细胞的定位没有明显的影响。在实验中,PRO-rich缺失的GFP融合蛋白在细胞中形成明亮的点状,而PRO-rich domain可以阻止这种明亮GFP点的形成。通过CO-IP实验,证明MAVS-like与zfTRAF3可以相互作用；利用原核表达系统,得到MAVS-like的兔多抗。利用真核、原核表达蛋白,通过Far-Western Blot实验,确认MAVS-like的CARD domain可以相互作用。　　 (3)SKIV是感染鱼类的一种重要的病毒,通过生物信息学分析表明该病毒的FLP(Ftsk Like Protein)基因,可能参与了病毒基因的转录调控,宿主的信号传导以及病毒本身染色体的复制,病毒包装与成熟等机制,因此,我们克隆了该基因,并构建了一系列的载体。FLP由3762个碱基编码1253个氨基酸,是SKIV,也可能是虹彩病毒中分子量最大的一个蛋白。FLP含有一个SAP,一个FtsK和一个Glu domain,SAPdomain只在真核生物中有发现,FtsK domain则一般发现在原核生物中,而Gludomain则在原核,真核中都有发现,SKIV中发现的这个基因,可能具有这3种domain,将真核,原核,病毒各进化层次的物种所具有的domain融合在一起。细胞定位实验表明该基因全长部分入核,分别包含有上叙3种domain的片段都完全入核,因此可以推断它最少具有3个NLS,因此,它入核信号的调节信号应该是很复杂的。实验表明该蛋白是一个抑制型转录因子,抑制宿主的NF-κB,INF-β信号通路,甚至还可以抑制宿主的Glu酶的活性。QRT-PCR表明,它在MCP的表达之后,所以该基因是一个晚期表达基因。　　 此外,构建了FLP-RNAi载体,可以为后期的工作作准备,同时,鉴定了FtsK domain不定位在核体区域(NBs)。