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背景和目的骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BMMNCs)是一个由多种细胞成分构成的异质群,因含有多种干细胞成分并能分化为内皮细胞和平滑肌细胞,在下肢及心脏缺血性疾病中展现了较强的促新血管形成能力。本研究观察移植的BMMNCs能否在缺血性脑卒中的微环境中通过分化促进血管新生及动脉形成,进而促进神经功能的长期恢复。方法1、 BMMNCs的标记、提取及细胞成分鉴定：通过连续腹腔注射BrdU ((50mg/kg/day,14d)的方法标记BMMNCs;采用梯度离心法提取BMMNCs,使用流式细胞术分析BMMNCs表面分化抗原CD34. CD45、 CD90、 CD117的阳性率及BrdU标记率。2、实验动物与分组：清洁级成年雄性Sprague-Dawley (S-D)大鼠(3月龄,体质量300-310g)150只,按随机数字表法分为4组：①假手术组(sham-operated group)(n=26);②缺血组(untreated ischemic group)(n=34);③溶剂治疗组(vehicle-treated ischemic group)(n=36);④骨髓单个核细胞治疗组(BMMNC-treated ischemic group)(n=54)。3、脑梗死模型、细胞移植、标本制备及检测指标：采用线栓法制备大鼠永久性大脑中动脉闭塞(permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)动物模型,通过股静脉移植BMMNCs; pMCAO术后每周评价体质量的改变,并采用改良神经功能损害评分表(modified neurological severity scores, mNSS)评价脑梗死大鼠神经功能缺损症状的改善情况,连续评价42d；pMCAO术后7d行TTC染色检测脑梗死体积,术后14d、42d行乳胶灌注术评价软脑膜动脉、Willis环动脉及基底动脉的直径、形态。pMCAO术后7d、14d、28d、42d应用免疫荧光技术观察移植的细胞在颅内的分布、分化、促进血管新生及动脉形成情况。4、统计学方法：所有数据均以均数±标准差(x±S)表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析,体质量、mNSS评分采用重复测量方差分析,余数据采用单因素方差分析,组间进一步比较采用LSD法,以a=0.05作为显著性检验标准。结果1、 BMMNCs的BrdU标记率及CD34、 CD45、 CD90、 CD117表面分化抗原阳性率分别为65.5±6.2%、14.9±1.1%、84.4±1.1%、10.0±0.6%、13.5±0.7%(n=5)。2、 BMMNCs移植促进神经功能的恢复。mNSS评分显示,经历pMCAO术的大鼠均显示不同程度的神经功能缺损,mNSS评分增加。pMCAO术后7d,BMMNCs治疗组大鼠的mNSS评分明显低于缺血组及溶剂治疗组,差异有统计学意义(P＜0.05；n=12)；体质量评价提示,四组大鼠在pMCAO术后7d均明显下降,然后缓慢增长；BMMNCs治疗组大鼠在pMCAO术后14d恢复到基线水平,而缺血组及溶剂治疗组需要28d才能返回到基线水平,但是组间差异无统计学意义(F=1.837,P＞0.05；n=12)。3、 BMMNCs移植减少脑梗死体积。pMCAO术后7d,TTC染色显示,BMMNCs治疗组大鼠的脑梗死体积较溶剂治疗组及缺血组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05；n=6)。4、 BMMNCs移植促进动脉形成。乳胶灌注显示,BMMNCs治疗组大鼠的软脑膜动脉、Willis环及基底动脉的直径明显增粗,与缺血组及溶剂治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05；n=6),BMMNCs治疗组大鼠的软脑膜动脉开放数目亦明显增多,与溶剂治疗组和缺血组比较,差异有统计学意义(P＜0.05;n=6),同时发现缺血组及溶剂治疗组大鼠软脑膜动脉多于假手术组,差异有统计学意义(P＜0.05；n=6),但是缺血组及溶剂治疗组大鼠的Willis环及基底动脉的直径均与假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05；n=6)。5、 BMMNCs通过分化为内皮细胞及平滑肌细胞促进血管新生和动脉形成。免疫荧光染色显示,移植的BMMNCs在脑梗死后14d开始整合进入软脑膜动脉及脑实质微血管的管壁中,并分化为内皮细胞及平滑肌细胞,执行血管重塑功能至少42d以上；在脑梗死后42d,BMMNCs治疗组大鼠梗死侧毛细血管数目及微动脉数目明显多于溶剂治疗组、缺血组及假手术组,差异有统计学意义(P＜0.05；n=6)；同时,缺血组大鼠毛细血管数目高于假手术组,差异有统计学意义(P＜0.05；n=6)。结论1、BMMNCs可通过梯度离心法分离提取,该方法简单、方便、快捷；通过腹腔注射BrdU的方法标记BMMNCs,标记率高,操作简单、可行,能满足细胞移植要求。2、BMMNCs移植在脑梗死7d后就能够明显减少脑梗死体积,促进的神经功能恢复,但是对体质量的改变无影响。3、 BMMNCs在脑梗死后14d整合进入脑实质的微血管和软脑膜动脉的管壁中,通过分化为内皮细胞及平滑肌细胞促进血管新生及动脉形成。4、 BMMNCs能够同时促进软脑膜动脉、Willis环及基底动脉的重塑,并执行血管重塑功能至少42d以上。