小檗碱(berberine，BBR)的降糖作用已在二型糖尿病病人中得以证实。机制研究表明，BBR激活肌肉和肝等胰岛素敏感细胞内的AMPK(AMP-activatedproteinkinase)，AMPK通过不依赖胰岛素的信号通路，增加肌肉组织对葡萄糖的摄取，减少肝脏的糖异生，从而引起机体血糖的下降。本研究发现，BBR激活包括MRC-5（人胚肺细胞），Caco-2（人结直肠癌细胞），HCT-116（人结直肠癌细胞），PC-3（人前列腺癌细胞），HL-7702（人肝细胞），BEL-7402（人肝癌细胞）和HepG2（人肝癌细胞）在内的多种细胞中的AMPK，激活作用可被AMPK的抑制剂CompoundC(CC)所抑制。BBR激活AMPK的机制可能与其抑制细胞线粒体的电子传递有关。BBR增加人肝细胞HL-7702和HepG2，以及啮齿动物肌肉细胞L6和C2C12的糖消耗量；但BBR增加糖消耗的作用不能被CC抑制，也不受干扰RNA介导的AMPK表达下调的影响；说明细胞内可能存在其它的蛋白或机制具有和AMPK及其调控通路类似的作用，此问题将在下文中详细阐述。葡萄糖消耗量能够直观地反映细胞对葡萄糖利用的情况，本研究采用了这一指标衡量BBR等化合物的体外降糖效果。　　 因此，本文设计构建了分别针对AMPK活性和糖消耗量的细胞筛选模型，用以评价BBR结构类似物的体外降糖活性。本项目通过化学修饰和改造，得到42个BBR的结构类似物；分别使用上述两种筛选模型进行评价。结果发现，化合物M2B1虽然激活AMPK的作用比BBR强，但具有毒性。在糖耗量筛选中，BBR的活性最强；T-1-2、J-70和470三个化合物糖消耗的活性与BBR接近，分别是BBR的87％，85%和87%，目前正在进行深入的研究。本文分析了BBR衍生物增加细胞糖消耗量的构效关系，为BBR进一步的化学改造提供了研究基础。　　 异小檗碱（isoberberine，开发后命名为IMB-Y53，以下简称Y-53）也是上述衍生物中的一个，结构上是BBR的同分异构体。本室前期研究发现，Y-53在实验动物中口服安全性好，且降脂作用优于BBR。本研究首次报道，Y-53也具有降糖作用。细胞水平上，Y-53可以时间和剂量依赖性的激活肌肉细胞L6和C2C12中的AMPK;Y-53对AMPK的激活作用可以被CompoundC抑制；Y-53增加肝和肌肉细胞的糖消耗，但活性不能被CompoundC抑制；Y-53的体外作用与BBR是一致的，但活性弱于BBR。在KK-Ay二型糖尿病小鼠模型中，使用100mg/kg/day的Y-53治疗使小鼠血糖下降28%，与使用300mg/kg/day二甲双胍(metformin)治疗的效果相当（血糖下降30%）；两种药物都降低了肥胖小鼠的体重（Y-53组降低10.6%，metformin组降低11.4%）；同时，Y-53使肥胖小鼠的胆固醇和甘油三酯水平分别下降了11%和44%，而二甲双胍没有这些作用；结果提示，BBR类化合物应用于代谢调控具有其特殊的优势。Y-53体外增加糖消耗的能力仅为BBR的50-63%，但在db/db二型糖尿病小鼠模型中，Y-53的降糖效果却与BBR相当，甚至略优于BBR，其机理主要是增加了生物利用度（已由本室的另一位博士完成）。　　 如上文所述，BBR的降糖作用可能并不依赖于AMPK。本研究室的前期工作表明，BBR使细胞内PKD的916位丝氨酸自磷酸化而激活，进而促进胰岛素受体(insulinreceptor，InsR)基因的转录，增加InsR在细胞膜上的表达，从而提高二型糖尿病病人的胰岛素敏感性，降低病人的血糖。本研究发现，BBR和Y-53治疗组db/db糖尿病小鼠的肝和骨骼肌中，AMPK被激活，同时InsR的表达普遍升高。因此，InsR介导的胰岛素通路可能是BBR和Y-53发挥降糖作用的另一条重要途径，Y-53和BBR的降糖机制可能与它们调控胰岛素信号通路和AMPK信号通路都有关。　　 除了上述的BBR衍生物，本文还进一步研究了BBR的代谢产物对上述BBR作用靶点(LDLR、InsR、AMPK)和糖消耗量的生物学活性。人体内BBR经一相代谢产生4个主要的代谢产物M1～M4。为探讨BBR的代谢调控作用是BBR自身的作用还是这些代谢产物的作用，本研究比较了BBR与4个代谢产物对上述靶点和葡萄糖消耗量的活性强度。结果发现，产物M1～M4都可以增加HepG2细胞内InsR的表达；M1和M2可以增加HepG2细胞内低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor，LDLR)的表达，M3和M4没有作用；M1和M2可以激活HepG2细胞内的AMPK，而M1～M4都可以激活大鼠骨骼肌L6细胞中的AMPK;四种代谢产物都可以增加肌肉细胞L6和C2C12对葡萄糖的消耗；对于上述靶点和生物学效应，代谢产物的作用强度都不如BBR本身，所以发挥代谢调控作用的主要化学实体是BBR本身，而不是其代谢产物。另外，代谢产物的生物活性虽然都不如BBR，但它们的结构中具有可被修饰的羟基（如图15所示），可以在化学改造中加以利用。　　 BBR的生物利用度较低（不足5%）。近几年本研究小组尝试多种手段提高BBR的体内药效。理论上，增加口服生物利用度可能提高BBR降糖的效果。前药制备是提高药物生物利用度的重要手段之一，但BBR的结构不易改造成前药，所以我们决定挑选有活性的BBR代谢产物进行前药合成，来探讨增加生物利用度能否提高BBR类化合物的体内药效。由于结构中E环开放的产物M3和M4（结构如图15所示），在HepG2细胞中丧失了对AMPK和LDLR的药效（如图16.B和C所示），因此被放弃。如上文所述，尽管弱于BBR，但产物M1保持了所有BBR的生物学活性，且对于LDLR的活性优于其它代谢产物；因此，本文最终选取了M1作为活性基团进行前药合成与评价。　　 本研究发现，将代谢产物M1的9位羟基棕榈酸化，得到的前药化合物5g，具有较好的脂溶性(2＜LogP＜7)和血浆酯酶水解速率；前药5g长期给药不影响大鼠的肝肾功能，表明其具有良好的安全性；在二型糖尿病模型小鼠KK-Ay上,5g具有和BBR相当的降糖效果（100mg/kg/day的5g治疗组血糖下降26%，100mg/kg/day的BBR治疗组血糖下降28%）。从不同细胞的糖消耗量上看，M1的生物活性仅为BBR的15-46%，但制成前药增加脂溶性及生物利用度后,5g与BBR在动物水平的降糖效果相当。这说明，增加生物利用度可以提高BBR类化合物的体内药效，这为BBR的改造提供了研究方向。另外，化合物5g需要进入血液才能大量释放出有效成分M1，提示BBR类化合物需要进入血液才能发挥代谢调控作用。　　 综上所述，本研究表明BBR可在体内和体外激活AMPK，但其降糖作用可能并不依赖于AMPK。针对抑制线粒体电子传递发挥作用的降糖药物（如BBR和二甲双胍），本研究构建了细胞水平测定葡萄糖消耗量的筛选模型，分析总结了BBR类似物对细胞糖消耗量的构效关系，为BBR的化学改造提供了理论基础。本研究首次证实了Y-53的降糖作用，与BBR相同，Y-53也具有同时调控血糖和血脂的优点。本研究发现，BBR四个主要一相代谢产物(M1～M4)的生物学活性不如BBR；因此，发挥代谢调控作用的主要化学实体是BBR本身，而不是其代谢产物。本研究以代谢产物M1为结构基础，成功制备了前药5g;在动物模型上,5g具有与BBR相当的降糖效果，证明增加生物利用度有利于提高BBR类化合物的体内药效。本研究充实了BBR类化合物降糖作用的分子机理，了解了更多BBR类化合物降糖的化学基础。