1.背景口腔颌面部恶性肿瘤约占全身恶性肿瘤的0.94%,其中最常见的是鳞状细胞癌,约占口腔颌面部恶性肿瘤80%以上,舌鳞状细胞癌在我国口腔颌面部恶性肿瘤中的发病率约为32.3%。舌鳞状细胞癌多发生于舌前灵活活动部位,发生于舌中1/3边缘部的占50%以上,其次为舌根、舌背、舌底及舌尖部。致病因素包括饮酒、吸烟、尖锐的残根残冠长期机械性损伤和人类乳头瘤状病毒感染等等。由于舌的机械运动频繁以及口腔颌面部的淋巴及血运相对丰富的生理特点,舌鳞状细胞癌易通过淋巴和血液循环通路全身转移,在肿瘤早期即可发生转移。临床对舌鳞状细胞癌的治疗主要以手术切除肿瘤组织为主,放射治疗及化学药物治疗为辅的综合治疗手段,希望可以较大幅度地提高治愈率,改善患者的生活质量,但治愈率仅为10%-45%。近年来,抗血管生成治疗逐渐成为抗肿瘤治疗的另一种方法。肿瘤生长、转移均依赖新生血管的形成,而且肿瘤诱导血管生成的能力与其侵袭能力相关。在肿瘤发生的早期,肿瘤细胞主要通过组织渗透而维持其生长,但当肿瘤直径超过1-2cm后,肿瘤必须形成能供给自身营养的新生血管。既往广泛认可的肿瘤血管新生途径是内皮依赖性新生血管途径。抗血管生成治疗,或称之为肿瘤血管治疗,是与传统化疗完全不同的肿瘤药物治疗,其药物作用的对象不是肿瘤细胞本身,而是在分子水平通过抑制或破坏肿瘤血管生成控制肿瘤生长,从而达到抗肿瘤治疗的目的。抗血管生成治疗主要有两种方式,一是阻止肿瘤生长所需的新生血管形成,二是破坏肿瘤组织中已存在的肿瘤血管。理论上,抗血管生成治疗理应具有良好的治疗效果,然而,临床研究却显示抗内皮细胞治疗肿瘤疗效并不令人满意。这可能与肿瘤除肿瘤血管生成途径以外,还可以其他途径获得血液供应有关。血管生成拟态(Vasculogenic Mimicry VM)是近年来提出的一个肿瘤微循环的全新概念。与经典肿瘤血管生成途径不同的,VM是不依赖血管内皮细胞的微循环模式,肿瘤细胞围成管道,管道内由PAS染色阳性的细胞基质膜包绕,形态上呈多样性并连接呈网络,部分管腔内见红细胞,经血管造影显示有血流通过,证实为血管样结构,并经过光镜,透射电镜及血管内皮细胞标志物的免疫组化检测,均没有发现血管内皮细胞的存在。这种为肿瘤供血的不同于传统血管生成的血管样结构,称为VM。VM的特点是：管腔内没有血管内皮细胞,肿瘤细胞模仿机体血管生成并通过自身变形和厚薄不一的PAS染色阳性的细胞基质膜形成管道,血液在这种管道中流动。国内外学者普遍认为具有VM的肿瘤有恶性度高,生长迅速,转移率高,易发生血道转移,可能与血管无内皮细胞衬覆,肿瘤直接与血液接触有关。VM的提出对以内皮依赖性血管是肿瘤微循环唯一方式的传统观念提出了挑战,同时也是对肿瘤血管生成理论的重要补充。与经典的血管生成途径完全不同,VM是高侵袭性肿瘤为了满足自身的血液供应,通过自身表型和细胞外基质重塑而围成的一种类血管样的管道,是不依赖血管内皮细胞的一种肿瘤微循环模式。VM的发现解释了以抑制肿瘤血管生成为主要作用靶点的抗肿瘤治疗效果不佳的原因。自VM发现以来,人们开始认识到内皮细胞依赖的肿瘤血管生成并不是肿瘤唯一的微循环模式,在抑制肿瘤微循环的治疗中兼顾VM与血管生成,尤其重视VM的治疗才能获得良好疗效。人们认为VM的存在与肿瘤的生长、分化程度、侵袭性等密切相关,具有VM的肿瘤预后更差。有学者提出抗血管生成治疗和抗血管生成拟态形成联合应用从而抑制肿瘤生长的设想。因为舌的机械运动频繁及淋巴血运丰富,舌鳞状细胞癌患者易发生早期淋巴结转移等特点,而VM存在的肿瘤也有易发生早期转移的特点。那么,专门针对舌鳞状细胞癌中VM的研究则对临床上舌鳞状细胞癌的治疗及评估预后具有针对性的意义,而国内外研究尚未见报道。因此研究VM在舌鳞状细胞癌患者侵袭转移过程中的关系,评估其临床和预后价值,对于作为未来控制舌癌术后侵袭转移的有效的治疗有非常重要的意义。2.目的我们通过采集本院临床资料完整、标本组织蜡块完好的舌鳞状细胞癌患者的石蜡病理标本,切片后进行HE染色及免疫组化染色,通过光学显微镜镜下观察了解在舌癌患者中是否存在VM并采集数据,分为VM阳性组和VM阴性组两组,结合患者年龄、性别、淋巴转移、肿瘤组织分化程度等临床资料,通过统计学方法分析两组与患者年龄、性别、淋巴转移、肿瘤组织分化程度的关系,为指导舌鳞状细胞癌患者的临床治疗提供理论基础。3.研究对象与方法3.1研究对象收集南方医科大学珠江医院2003年-2011年间手术切除的42例临床资料齐全、标本组织蜡块完好的舌鳞状细胞癌患者病理标本,年龄40-81(61.2±9.8)岁；男31例,女11例。淋巴结转移：已发生淋巴结转移者14例,无淋巴结转移者28例。组织学分级：高分化者20例,中分化者16例,低分化者6例。全部病例经术后病理证实为舌鳞状细胞癌,并且有完整的临床资料和病理资料,全部病例经过随访,方式包括门诊随访,住院复查,电话随访。3.2试剂应用鼠抗人单克隆抗体CD34(克隆号：QBEnd/10, Leica,7ml工作液)；即用型快捷免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒(KIT-5030,110ml,福州迈新生物技术有限公司)；PAS染色试剂盒(BA4080A,珠海贝索生物技术有限公司)。3.3标本制取将从南方医科大学珠江医院2003年-2011年间手术切除的42例临床资料齐全、标本组织蜡块完好的舌鳞状细胞癌患者病理标本,进行HE染色及CD34免疫组化染色结合过碘酸雪夫氏(Periodic acid Schiff, PAS)双重染色检测舌鳞状细胞癌中的VM。(1)HE染色：首先将舌鳞状细胞癌患者石蜡标本切片脱蜡,HE染色后,中性树胶封片,光学显微镜镜下观察。(2)CD34/PAS双重染色：将舌鳞状细胞癌患者石蜡标本切片脱蜡,行CD34免疫组化染色,显微镜下控制颜色发展情况,待血管内皮细胞着色后,终止显色反应,再将上述切片行PAS染色,光学显微镜镜下观察。3.4统计方法与统计软件采用SPSS13.0统计分析软件,频数资料采用四格表资料X2检验,和两独立样本非参数检验(秩和检验),分析两变量间的相关关系,P<0.05有统计学意义。将采集研究数据分为VM阳性组和VM阴性组两组,采用SPSS13.0统计分析软件,采用四格表资料X2检验,和两独立样本非参数检验(秩和检验),分析舌癌患者中VM与患者年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤组织分化程度的关系。4.结果4.1VM存在于舌鳞状细胞癌组织中经HE染色和CD34/PAS双重染色,在本实验42例舌鳞状细胞癌患者病理标本中,发现存在VM的比例为42.86%(18/42)。HE染色可见肿瘤细胞沿管道壁排列,围成管道状结构,内见红细胞。CD34/PAS双重染色见肿瘤细胞围成管道,管道内由PAS染色阳性的细胞基质膜包绕,管腔内见红细胞,这种管道状结构CD34染色呈阴性,证明其不是内皮细胞。VM管道结构围绕的细胞异型性明显,胞质丰富,呈颗粒状,核深染,核大呈结节状、分叶状等多种形态,核膜厚,核膜出现凹陷、皱褶,核膜呈锯齿状,染色质边移,核仁明显,出现巨大核仁,异常核分裂,核质比例增大,证实为癌细胞。4.2VM在舌鳞状细胞癌中的统计学意义本实验中,发现18例舌鳞状细胞癌患者病理标本中检测到VM,其中4例为高分化,9例为中分化,5例为低分化。是否存在VM与患者年龄、性别分别进行比较,差异无统计学意义；VM阳性组患者淋巴结转移率为50.00%,VM阴性组患者淋巴结转移率为20.83%,经X2检验,P=0.049,差异有统计学意义,可认为两组淋巴结转移率不同,VM阳性组舌鳞状细胞癌患者淋巴结转移率高于VM阴性组；是否存在VM与患者肿瘤组织分化程度进行比较,用Wilcoxon秩和检验,p=0.002,差异有统计学意义,可认为两组肿瘤组织分化程度不同,VM阳性组舌鳞状细胞癌患者肿瘤组织分化程度低于VM阴性组。5.结论1.CD34和PAS双重染色可有效观察舌鳞状细胞癌中的VM；2.恶性程度越高的舌鳞状细胞癌形成VM的能力越强；3.本实验检测到VM的舌鳞状细胞癌组织分化程度较低,更易发生淋巴结转移；