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目的通过观察阿仑膦酸钠对糖尿病性骨质疏松(Diabetic Osteoporosis,DOP)大鼠股骨组织miR-133a/Runx2相关基因以及股骨结构的影响,探讨阿仑膦酸钠对miR-133a调控骨质疏松的影响机制,为将来研发以miRNA为靶点的新型抗骨质疏松药物开发提供新的方向,并为DOP的治疗开辟新途径提供理论依据。方法选取8周龄的SPF级雄性Wistar大鼠40只,体重190-210g,适应性喂养4周后随机选取10只作为正常对照组(normal control,NC),剩余30只腹腔注射链脲菌素(streptozotocin,STZ,30 mg/kg),正常对照组注射等量的生理盐水。腹腔注射STZ72小时后用血糖仪测量大鼠尾静脉血糖,当血糖≥16.7 mmol/L时表示糖尿病模型造模成功。随后每4周测量一次骨密度,当糖尿病大鼠的骨密度降低与正常对照组有统计学差异的时候(p<0.05),将糖尿病大鼠随机分成3组:糖尿病模型组(diabetic mellitus,DM,n=10);mi R-133a拮抗剂组(miR-133a inhibitor,MI,30μg/4days尾静脉注射,n=10);阿仑膦酸钠治疗组(alendronate,AD,5mg/kg/week灌胃,n=10),正常对照组和糖尿病模型组大鼠给予等量的生理盐水灌胃,连续干预6周。第36周末处死,心脏采血测量血糖和骨代谢指标;同时分离股骨置于EP管快速投入液氮中,冻透后-80℃冰箱保存,用于RT-PCR和WB检测股骨组织中miR-133a、Runx2以及下游蛋白Osterix的mRNA和蛋白的表达;另一份用10%福尔马林固定,然后用10%的EDTA(PH=7.4)常温脱钙,石蜡包埋用于HE和Masson染色。结果大鼠的一般情况:糖尿病大鼠均出现多饮、多食、多尿、体重下降的“三多一少”症状,并逐渐出现皮毛枯黄无光泽、反应迟钝、活动减少等症状。STZ腹腔注射72小时后糖尿病大鼠体重逐渐下降,而正常对照组大鼠体重不断增高;同时糖尿病大鼠血糖一直大于16.7 mmol/L。RT-PCR检测:糖尿病模型组mi R-133a的表达明显高于正常对照组(p<0.05),Runx2和Osterix的mRNA表达明显低于正常对照组(p<0.05);miR-133a拮抗剂组和阿仑膦酸钠组miR-133a的表达明显低于糖尿病模型组(p<0.05),Runx2和Osterix的mRNA表达明显高于糖尿病模型组(p<0.05);然而,miR-133a、Runx2以及下游蛋白Osterix的mRNA表达在miR-133a拮抗剂组和阿仑膦酸钠组之间不具有统计学差异(p>0.05)。Western blot检测:糖尿病模型组Runx2和Osterix的蛋白表达明显低于正常对照组(p<0.05);miR-133a拮抗剂组和阿仑膦酸钠组Runx2和Osterix的mRNA表达明显高于糖尿病模型组(p<0.05);然而,Runx2以及下游蛋白Osterix的蛋白表达在miR-133a拮抗剂组和阿仑膦酸钠组之间不具有统计学差异(p>0.05)。骨代谢标志物检测:与正常对照组比较,糖尿病模型组大鼠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、I型原胶原羧基端延长肽(procollagen type I C-terminal prepeptide,PICP)和I型原胶原氨基端延长肽(Procollagen type I N-terminal prepeptide,PINP)明显降低(p<0.05);与糖尿病模型组相比,miR-133a拮抗剂组和阿仑膦酸钠组ALP、PICP和PINP明显明显增高(p<0.05);然而,ALP、PICP和PINPmiR-133a拮抗剂组和阿仑膦酸钠组之间不具有统计学差异(p>0.05)。股骨micro-CT和病理学检测:36周龄时,与正常对照组完整致密的骨小梁微结构相比,糖尿病模型组呈现出明显的骨微结构退化,表现为骨小梁减少、变细、断裂,不能保持完整的微观构筑;然而,阿仑膦酸钠干预后骨微观结构得到明显改善。骨组织形态计量学参数定量分析表明:与正常对照组比较,糖尿病模型组的骨密度明显降低(p<0.05),骨小梁数量、骨小梁厚度和骨容积比降低,而骨小梁间隙和结构模型指数增高(p<0.05);与糖尿病模型组比较,阿仑膦酸钠干预组骨密度明显增高(p<0.05),骨小梁数量、骨小梁厚度和骨容积比增高,而骨小梁间隙和结构模型指数降低(p<0.05)。股骨组织的HE染色中胶原纤维被染成粉红色,Masson三色染色中胶原纤维呈蓝色。36周龄时,与正常对照组相比,糖尿病模型组骨小梁纤细、排列紊乱、吸收明显、数量减少、结构不完整、胶原纤维明显减少等骨质疏松状态表现;而在阿仑膦酸钠干预后,骨质疏松状态得到明显改善。结论1.在糖尿病性骨质疏松症大鼠的股骨组织中,调控成骨细胞分化的miR-133a表达增高,而Runx2/Osterix的m RNA和蛋白的表达均降低,骨形成降低。2.阿仑膦酸钠能够抑制miR-133a表达,上调Runx2/Osterix的mRNA和蛋白的表达水平,进而改善骨的微观结构和骨质疏松状态,这将为将来研发以miRNA为靶点的新型抗骨质疏松药物开发提供新的方向,并为DOP的治疗开辟新途径提供理论依据。