【摘 要】
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[目 的]本项研究的目的是为了验证E3泛素连接酶RNF165对乳腺癌细胞迁移的抑制,并且初步阐明其作用的分子机制,为乳腺癌诊断治疗提供新的靶点和思路。[方法]1、使用甲基化抑制剂(地西他滨)对乳腺癌细胞株处理不同时间梯度(48 h和72h)检测RNF165表达情况。2、运用划痕和Transwell实验验证RNF165对三阴性乳腺癌细胞HCC1806和MDA-MB-231迁移的影响。3、在过表达RN
【基金项目】
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国家自然科学基金(82060538); 国家自然科学基金(81660437);
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[目 的]本项研究的目的是为了验证E3泛素连接酶RNF165对乳腺癌细胞迁移的抑制,并且初步阐明其作用的分子机制,为乳腺癌诊断治疗提供新的靶点和思路。[方法]1、使用甲基化抑制剂(地西他滨)对乳腺癌细胞株处理不同时间梯度(48 h和72h)检测RNF165表达情况。2、运用划痕和Transwell实验验证RNF165对三阴性乳腺癌细胞HCC1806和MDA-MB-231迁移的影响。3、在过表达RNF165野生型、酶活突变体和对照的HCC1806、MDA-MB-231乳腺癌细胞株中,用TGF-β(10 ng/ml)分别刺激不同时间(24 h和48 h),利用Western Blot检测TGF-β信号通路及下游靶基因活化情况(p-Smad2/3、PAI-1、Snail、Slug 等)。4、在HCC1806细胞系中构建稳定过表达RNF165酶活突变体的稳转细胞株,利用IP-MS(免疫沉淀-蛋白质谱)方法找出RNF165的特异性相互作用蛋白,并且用免疫共沉淀(Co-IP)的方法进一步验证。5、敲低RNF165相互作用蛋白,检测其对TGF-β信号通路下游靶基因(p-Smad2/3、PAI-1、Snail、Slug)的影响。[结 果]1、地西他滨能够增加乳腺癌细胞HCC1806和MDA-MB-231的RNF165 mRNA表达水平。2、稳定过表达RNF165能够抑制乳腺癌细胞HCC1806和MDA-MB-231的迁移。3、稳定过表达RNF165可以负调控TGF-β信号通路,抑制其下游靶基因(PAI-1、Snail、Slug)的表达4、RNF165与分子伴侣蛋白CCT6A存在相互作用,但是RNF165不影响CCT6A蛋白表达水平。5、敲低CCT6A可以抑制TGF-β信号通路下游靶基因(PAI-1、Slug)的表达。[结论]E3泛素连接酶RNF165在乳腺癌细胞中发挥着重要的功能。其表达受到启动子DNA高度甲基化的抑制,使用甲基化抑制剂可以上调RNF165的mRNA水平。在两株三阴性乳腺癌细胞HCC1806和MDA-MB-231中过表达RNF165可以抑制癌细胞的迁移,且抑制功能依赖于其酶活。分子机制上,我们初步发现RNF165可以负调控TGF-β信号通路下游靶基因(PAI-1、Snail、Slug)的表达。此外,RNF165与分子伴侣蛋白CCT6A存在相互作用,但是RNF165不影响CCT6A蛋白表达水平,敲低CCT6A可以抑制TGF-β信号通路下游靶基因(PAI-1、Slug)的表达。但是RNF165是否通过抑制CCT6A从而发挥抑癌作用还需要进一步实验解析。
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