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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经退行性疾病,其最主要的病理学特征为黑质致密带（substantia nigra par compacta,SNpc）多巴胺（dopamine,DA）能神经元脱失及伴发的纹状体轴突末梢DA的耗竭。PD的病因目前尚未完全明了,与遗传因素、环境因素、氧化应激、兴奋性毒素、自身免疫、黑质（substantianigra,SN）铁聚积和细胞凋亡等多种因素有关。近年来对PD患者中脑SN病变部位的研究发现,在DA能神经细胞中有染色质浓缩和凋亡小体等细胞凋亡的特征性变化,提示细胞凋亡在DA能神经元死亡中的作用。因此开发新型的能够防治PD的药物将具有不可估量的社会和经济效益。Ghrelin是1999年由日本科学家Kojima等人发现的一种脑-肠肽,由28个氨基酸残基组成,为生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor,GHS-R）的唯一内源性配体,有刺激食欲,促进摄食,增加体重以及保持能量平衡等作用。最近的研究表明Ghrelin能够刺激脂肪前体细胞、成骨细胞等多种细胞的增殖并具有抑制凋亡的作用,GHS-R 1a特异性拮抗剂D-Lys3-GHRP-6能阻断Ghrelin抑制脂肪前体细胞和体外培养的下丘脑神经元凋亡的作用。黑质GHS-R的表达仅次于下丘脑,Ghrelin在黑质可能具有非常重要的生理作用。我们的前期工作观察到Ghrelin能够明显拮抗由1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）导致的小鼠SN DA能神经元的缺失,但其机制尚不清楚。因此,我们应用离体实验,在MES23.5多巴胺能细胞上,应用MTT、细胞内乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）、免疫荧光双标技术、蛋白印迹、Hochest染色、流式细胞仪计数、小干涉、基因转染等综合技术,阐明了Ghrelin对1-甲基-4-苯基吡啶阳离子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion,MPP+）诱导的多巴胺能细胞损伤具有保护作用,并探讨了其保护作用的机制。实验结果如下:1、MES 23.5细胞上有Ghrelin的受体GHS-R1a的表达。2、用不同浓度的MPP+（0-1000μmol/L）孵育细胞24h后检测细胞的存活率,发现当MPP+的浓度是10-1000μmol/L时,细胞的存活率都有明显的下降,LDH释放的测定得到相似的结果。200μmol/L的MPP+浓度被选为以后实验的浓度。MPP+（200μmol/L）处理MES23.5细胞24h后,细胞存活率明显降低,与对照组相比,降低至68.37%。而用(10-7-10-12mol/L)的Ghrelin预孵育20 min后,能够明显拮抗MPP+引起的细胞存活率的下降,与对照组相比,细胞的存活率分别上升到89.57%,87.16%,93.67%,88.45%,86.88%,and 82.46%。10-9mol/L Ghrelin对细胞的保护作用最为明显,LDH释放的测定也证实了用10-9mol/L Ghrelin预孵育20min,可以明显降低由MPP+引起的细胞内LDH的释放量。3、MPP+处理的MES23.5细胞出现明显的凋亡的形态学改变,如细胞核的固缩,核碎裂等。细胞线粒体跨膜电位（mitochondrial transmembrane potential,△ψM）降低,细胞内活性氧（reactive oxidative species,ROS）的生成增加,凋亡效应酶Caspase-3的活性也明显增加,而10-9mol/L Ghrelin预孵育20min,上述变化明显减轻。4、Ghrelin可以迅速导致细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal regulatedprotein kinase,EKR）激活。用ERK1/2阻滞剂PD98059预处理30 min后,可以阻断Ghrelin导致的ERK1/2的激活作用。并且PD98059能明显阻断Ghrelin对MES23.5细胞的保护作用,细胞的存活率,△ψM和ROS均出现逆转。6、应用蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）的阻滞剂（GF109203X）或酪氨酸蛋白激酶（Protein tyrosine kinase,PTK）的阻滞剂（tyrphostin-23）都可以阻断Ghrelin激活ERK1/2的作用。GF109203X和tyrphostin-23能明显阻断Ghrelin对MES23.5细胞的保护作用,细胞的存活率,△ψM和ROS均出现逆转。7、GHS-R1a高表达后上述Ghrelin的保护作用明显增强,表现为在低浓度Ghrelin(10-13mol/L)即可明显抑制细胞内MPP+诱导的ROS的生成,而相同浓度的Ghrelin在空载体转染的细胞中的保护作用不明显。8、将转染携带GHS-R 1a siRNA的质粒转染MES23.5细胞,干涉掉细胞膜上GHS-R1a的表达后,Ghrelin的保护作用明显减弱。上述结果说明,MPP+处理的MES23.5细胞,细胞存活率明显降低,细胞核出现固缩、碎裂等形态学改变,ROS生成增加,△ψM降低以及Caspase-3的激活。Ghrelin预处理的MES23.5细胞,能够拮抗MPP+对细胞的毒性作用,其保护作用的机制与其抗凋亡及抗氧化机制相关。Ghrelin能够激活EKR1/2相关信号转导通路,说明其抗凋亡的机制与有丝分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）、PKC和PTK信号转导通路的激活相关。高表达GHS-R1a的MES23.5细胞,能明显增强Ghrelin拮抗MPP+对细胞的毒性作用,而通过RNAi干涉掉GHS-R1a后,可以明显阻断Ghrelin的保护作用,说明Ghrelin发挥保护作用是通过其受体GSH-R1a实现的。作为内源性的肽类物质,其对人体的副作用小,而且其分子量仅3314Da,能够自由通过血脑屏障,可以进行外周给药,在PD的治疗和预防方面具有广阔的开发前景和应用价值。本项目为开发具有我国知识产权的新药提供可靠详实的基础研究资料。