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丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶,它们的活性部位通常都含Ser、His、Asp三个氨基酸,并具有相同的催化机制。丝氨酸蛋白酶在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用,它们通过对蛋白酶原的激活或抑制而起调节因子作用。丝氨酸蛋白酶还在胚胎发育、组织重建、细胞分化、血管形成和病原侵入等过程中都发挥着重要的作用。其中尿激酶型纤溶酶原激活剂和人凝血因子Ⅺ作为两种重要的丝氨酸蛋白酶,在药物设计和研究丝氨酸蛋白酶水解机制方面都发挥重要的作用。研究蛋白和抑制剂/底物的复合物结构,可以从分子水平上了解这些蛋白作用的机理,为先导药物的筛选提供结构平台,具有十分重要的意义。
本论文中,我们对尿激酶与抑制剂/底物复合物晶体做了结构生物学方面研究。同时利用毕氏酵母表达系统成功表达纯化了尿激酶原(154-411)和人凝血因子Ⅺ催化结构域,并结晶了尿激酶原抗体Fab112晶体。主要研究内容如下:
1.尿激酶-抑制剂/底物复合物晶体结构研究
尿激酶是一种丝氨酸蛋白酶,是体内纤溶系统中的重要组成部分,参与体内肿瘤细胞的侵袭和转移等多种生理病理活动。尿激酶与抑制剂/底物复合物晶体结构的研究能够为基于尿激酶为靶点的药物设计和丝氨酸水解酶水解机制两方面的研究都提供结构信息。在尿激酶抑制剂研究方面,我们解析了5个小分子抑制剂、2个多肽抑制剂MH013和MH027与尿激酶复合物品体结构,从结构角度阐明尿激酶与抑制剂的相互作用,为进一步研究高亲和力和高特异性的尿激酶抑制剂提供结构基础。在丝氨酸蛋白酶水解机制方面,我们解析了尿激酶与多肽底物M1100在4个不同pH条件下(pH4.6、pH5.5、pH7.4、pH9.0)的高分辨率复合物晶体结构,通过比较不同pH条件下的晶体结构,我们发现尿激酶结构中,Asp194和Ile16之间的盐键并没有随着pH条件的改变而发生构象变化。另外底物M1100在低pH值条件下Arg4-Gly5肽键并没有被水解,而在高pH条件下,底物M1100被尿激酶水解,并观察到水解过程中,P1基团的存在和水分子(W503)取代P1基团。我们推测水分子(W501)进入S1口袋区促使水解产物P1基团离开S口袋区。尿激酶-M1100在不同pH条件下的复合物晶体结构为研究丝氨酸蛋白酶水解机制提供了结构基础。
2.尿激酶原(154-411)表达纯化
尿激酶原是单链尿激酶型纤溶酶原激活剂,既是一种酶原又带有催化活性。利用重叠延伸PCR方法扩增得到尿激酶原(154-411)片段,将其克隆至表达载体oPICZαA上,转化酵母X-33,Zeocin抗性筛选酵母菌落,成功地表达了可溶性的尿激酶原(154-411)蛋白。重组蛋白的表达产量约为50mg/L。通过Ni柱亲和层析柱和Superdex75 HR10/30纯化,我们得到高纯度的重组蛋白,发色底物和抗体Fabll2结合实验都表明其具有生物学活性。同时我们得到了尿激酶原(154-411)和抗体Fab112晶体。这些研究工作为进一步探索抗体Fab112抑制尿激酶原的分子机理奠定基础。
3.人凝血因子Ⅺ表达,纯化及结晶
人凝血因子Ⅺ是一种丝氨酸水解酶,在凝血途径中发挥重要的作用。克隆人源凝血因子Ⅺ催化结构域到表达载体pPICZαA上,并分别定点突变糖基化位点(N432Q/N473Q)和游离半胱氨酸(C482),转化酵母X-33,用Zeocin抗性筛选酵母菌落。重组菌经甲醇诱导表达后,发酵上清通过阳离子琼脂糖凝胶柱一步纯化即可得到纯度达98％的重组蛋白。采用座滴气相扩散法获得了rhFⅪ370-607(N432Q/N473Q/C482S)蛋白晶体,为进一步研究FⅪ催化结构域结构和利用FⅪ催化结构域作为重要的靶标开发新颖抗凝血剂奠定了基础。