苜蓿多糖(Alfalfa polysaccharides,APS)是一种天然活性植物多糖,在以往的研究中发现APS具有改善畜禽生长、体外抗氧化活性和抗肿瘤等作用,而其免疫调控活性及其机制尚不清楚。为进一步揭示APS的免疫功能及其机制,本课题通过体内外试验相结合的方式,在小鼠及保育猪上研究了APS是否具有免疫调控活性;体外试验,构建APS对小鼠脾脏淋巴细胞、RAW 264.7巨噬细胞的培养模型,探索APS免疫调控的内在作用机制。1.苜蓿多糖粗提物的纯化、化学组分及单糖构成分析本研究在试验室APS水煮醇沉提取工艺基础上,设计透析工艺剔除小分子杂质以获得纯度较高的APS。化学组分检测结果表明,纯化后APS总糖含量90.04%、黄酮0.78%、皂甙1.77%、蛋白1.92%、水分3.03%、灰分2.47%。离子色谱分析结果显示,APS主要由8种单糖组成即:岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸,其分子摩尔比为1:3.09:1.81:8.20:1.21:1.42:28.5:5.71。2.APS对小鼠机体免疫、抗氧化和肠道形态的影响试验将64只小鼠随机分为4组,每天分别灌服低、中、高剂量的APS(200、400、800 mg/kg体重),空白对照组灌服等量无菌生理盐水,试验期28 d。结果表明,各处理组小鼠生长状况良好,灌服中、高剂量APS提高小鼠ADG(P<0.05),促进生长。中、高剂量APS显著提高小鼠血液白细胞和淋巴细胞总数(P<0.05),并随APS剂量升高呈一次(P<0.01)与二次(P<0.05)升高;高剂量APS显著改善脾脏和胸腺指数(P<0.05)。APS通过提高器官SOD(P<0.001)以及GSH-Px(P<0.05)活性,降低心脏和肝脏MDA水平(P<0.05),表现出显著的抗氧化活性。此外,试验结果还表明,APS能够显著提高小鼠十二指肠、空肠和回肠绒毛高度和绒腺比(P<0.01),降低十二指肠隐窝深度(P<0.01),改善肠道健康。3.APS对保育猪脾脏及外周血淋巴细胞的免疫激活作用本试验旨在初步研究不同水平APS对猪脾脏淋巴细胞及外周血淋巴细胞的免疫激活作用。试验选取24头体况相似、健康的三元杂交保育猪,随机分为4个处理,对照组饲喂基础日粮,试验组日粮含不同水平APS(300、500和800 mg/kg),试验期42 d。试验结束前采集血液测定外周血淋巴细胞体外增殖活性;试验结束后,无菌采取脾脏组织,分离淋巴细胞测定细胞增殖活性及IgM分泌水平。结果显示,500和800 mg/kg APS显著提高脾脏器官指数(P<0.05)及淋巴细胞IgM分泌水平(P<0.05);各APS处理组脾脏淋巴细胞与外周血淋巴细胞体外增殖活性均显著高于对照组(P<0.05)。4.APS对小鼠脾脏T、B淋巴细胞的免疫调控及其机制研究为探索APS的免疫调控机制,课题首先构建小鼠T、B淋巴细胞的体外培养模型,以确定APS对淋巴细胞是否存在免疫调控活性。试验用不同浓度APS(5-30μg/mL)培养T、B淋巴细胞,并设置阳性对照Con A(5μg/mL,T细胞)和LPS(10μg/mL,B细胞),测定细胞增殖活性、细胞因子或IgM分泌水平。结果表明,各浓度APS对T、B细胞均无细胞毒性;Con A处理提高T细胞增殖活性与细胞因子L-2,IL-4和IFN-γ及其基因表达水平(P<0.01);而不同梯度APS与空白对照组无显著差异(P>0.05)。APS与LPS培养的B细胞,其增殖活性均显著提高(P<0.01),且10μg/mL的APS促增殖效果最好;定量溶血分光光度法检测IgM分泌水平发现在10μg/mL的APS处理下,IgM分泌水平显著提高(P<0.01),这说明APS可特异性激活B淋巴细胞的免疫活性,10μg/mL的APS为最适剂量,并用于后续研究。随后,试验探索APS激活B细胞的膜受体和上游信号通路。TLR4阻断试验结果显示,TLR4受体阻断组IgM水平显著低于未阻断组(P<0.01),证明TLR4为APS结合B细胞的主要膜受体;同时,在TLR4基因缺失小鼠上的试验验证了此结论。对TLR4-MyD88介导的信号通路的分析结果说明,APS可显著提高TLR4、MyD88及IRAK1蛋白水平(P<0.05),且在第3 h表达量最高;然而,APS对TLR4-MyD88介导的信号通路上主要因子的基因表达水平影响不显著(P>0.05)。在APS激活B细胞下游信号通路试验中,通路阻断试验结果显示,分别单独阻断MAPK(p38、ERK1/2、JNK)与NF-κB通路时,IgM水平显著低于空白对照组(P<0.01),而显著高于各通路均阻断的阴性对照组(P<0.01),证明MAPK与NF-κB通路均为APS激活B细胞的信号转导通路。同时,MAPK通路阻断组IgM分泌水平显著低于NF-κB阻断组;且p38通路阻断组IgM分泌水平最低(P<0.01),说明MAPK是主要信号通路,且p38是MAPK中主要通路。APS对MAPK与NF-κB信号通路蛋白水平影响的结果说明,APS显著提高3 h后p38(P<0.01)总蛋白水平,显著提高3、6 h后p38、ERK和JNK的磷酸化水平(P<0.01)。此外,APS孵育B细胞0.5、1、1.5 h时显著提高细胞核中NF-κB蛋白水平(P<0.01)。5.APS对小鼠RAW 264.7巨噬细胞的免疫调控及其机制研究试验设置不同梯度APS(5-500μg/mL)与不同梯度(0.1-5μg/mL)阳性对照LPS培养RAW 264.7细胞,检测细胞增殖活性以确定APS对巨噬细胞的调控活性。结果显示,各浓度APS对巨噬细胞均无细胞毒性;与空白对照组相比50、100μg/mL APS及各浓度LPS均显著提高RAW 264.7细胞增殖能力(P<0.01)。ELISA结果显示,不同浓度APS与LPS均显著提高NO与TNF-α的分泌水平(P<0.01),50、100μg/mL APS显著提高IL-6含量(P<0.05)。同时,各浓度APS显著提高iNOS基因水平(P<0.01),50、100与200μg/mL的APS显著提高IL-6与TNF-α基因表达水平(P<0.05)。在探索APS激活RAW 264.7细胞内部信号通路的研究中,通路阻断试验结果显示,MAPK或NF-κB阻断剂预处理的巨噬细胞,其TNF-α的分泌水平显著低于未阻断组(P<0.01),这表明MAPK与NF-κB均为APS激活RAW 264.7细胞的信号转导通路。同时,p38信号通路阻断组,其TNF-α分泌水平最低,这说明p38在MAPK信号通路中有着关键作用,此结果与APS激活B淋巴细胞的结果一致,证实APS通过MAPK与NF-κB信号通路激活免疫细胞活性的论断。此外,APS显著提高JNK、ERK总蛋白水平(P<0.05)与(P<0.01),且随APS剂量的增高呈剂量依赖性;50,100或200μg/mL的APS显著提高p-JNK与p-ERK表达水平(P<0.05)。50,100或200μg/mL的APS显著降低胞核中IκBα的蛋白表达水平(P<0.01),说明APS能够活化NF-κB,荧光免疫结果显示50μg/mL的APS与0.1μg/mL的LPS均显著提高NF-κB水平,并促进其核转移进程。综上所述,本课题得出如下结论:透析可提高多糖的纯度,本试验纯化的APS纯度为90.04%,由8种单糖组成。功能研究得出,APS可通过改善机体抗氧化水平和肠道形态来增强小鼠机体的免疫功能;APS能够激活猪淋巴细胞活性。机制研究得出,APS特异性激活小鼠B淋巴细胞、RAW 264.7巨噬细胞,对T淋巴细胞无激活作用。TLR4被证明是APS激活B淋巴细胞的主要膜受体;MAPK与NF-κB是APS激活B细胞与RAW 264.7巨噬细胞的信号通路,且APS激活MAPK的磷酸化,提高NF-κB的核转移。因此,作为一种天然免疫调节剂APS具有较大的开发潜力和应用前景。