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研究背景：食管鳞癌（ESCC）是食管癌最常见的亚型，亚洲以及非洲等地区存在较高的发病率，而我国尤其是南方沿海的潮汕地区是食管鳞癌的高发区。食管鳞癌的症状不明显，往往确诊时病情已经发展到了中晚期，所以食管鳞癌的5年生存率仅为15％-25%，而早期诊断能够帮助食管鳞癌病人有较好的的预后。上皮内瘤变被认为是食管鳞癌的癌前病变阶段，随着上皮内瘤变的发展其恶化为食管鳞癌的风险也随之增加。在潮汕地区食管鳞癌高发病率的基础上，项目组前期发现潮汕地区活检食管非癌标本中慢性炎症感染率为68.98%，且炎症等级、DNA损伤程度与食管增生等级呈正相关，这提示慢性炎症、DNA损伤参与了食管鳞癌的发生发展过程，然而在食管鳞癌的发展过程中基因组发生了何种变化尚未可知。随着二代测序技术的发展，已有多项研究对食管鳞癌的遗传分子变异进行了探索，这为我们描绘食管鳞癌癌变过程中基因组变异图谱提供了基础。 研究目的与意义：本研究首次利用全基因组、全外显子、靶向测序对食管鳞癌癌变过程中不同病变阶段的配对样本进行测序分析，从单核苷酸变异、拷贝数变异以及克隆分析等角度对食管鳞癌癌变过程中基因组变异进行动态分析，初步探讨了食管鳞癌癌变不同阶段的遗传变异特点以及在癌变过程中起关键作用的早期驱动变异。最终力争为筛选和建立用于高危人群预警和早期诊断的生物学技术和方法提供基础。 材料与方法： 1、食管鳞癌癌变过程中不同阶段样本的收集：本研究一共收集来自70例食管鳞癌患者的227例标本（其中包括正常对照，单纯增生组织，上皮内瘤变组织，食管鳞癌组织）。经研究对象知情同意后，采集的血液2ml，-80℃冰箱储存。组织标本经冰冻切片后进行HE染色进行组织类型分类，镜下显微切割将目的区域细胞分离下来。利用进口基因组DNA提取试剂盒提取血液与组织细胞全基因组DNA，并对DNA进行完整性以及纯度、浓度检测。 2、对癌变不同阶段组织样本进行炎症与DNA损伤检测：通过HE染色观察组织标本的炎症情况，通过免疫组化对DNA双链损伤标记物γH2AX的表达情况进行检测。 3、全基因组与外显子测序：将来自7例食管鳞癌患者的配对样本（包括正常对照，单纯增生样本，上皮内瘤变样本，食管鳞癌样本）进行全基因组测序文库构建，随后在 HiseqX-ten测序仪上进行测序。将来自18例食管鳞癌患者的配对样本（包括18例正常对照，7例单纯增生样本，20例上皮内瘤变样本，18食管鳞癌样本）进行外显子测序文库构建，在Hiseq2000测序仪上进行测序。对全基因组与外显子测序结果进行分析，得到癌变不同阶段的遗传变异特点以及显著变异基因。 4、靶向测序：基于全基因组与外显子测序结果以及食管鳞癌测序文献筛选出126个候选基因，在45例食管鳞癌患者配对样本（包括45例单纯增生样本，46例上皮内瘤变样本，45例食管鳞癌样本）中通过靶向测序对候选基因的突变情况进行验证。 5、将全基因组、外显子、靶向测序结果进行整合，对存在有害变异的基因通过HOTNET进行信号通路以及蛋白互作富集。 6、对配对样本的共享突变进行克隆性分析寻找主干变异（trunk variation）。 7、构建全基因组与外显子测序样本的癌变进化树。 研究结果： 1、在不同癌变阶段样本中炎症等级与食管上皮增生程度呈正相关，且DNA损伤也随着炎症等级、上皮增生程度的增加而加重。其次测序样本中突变率与γH2AX的阳性表达率呈正相关。上皮内瘤变样本与食管鳞癌样本中有大量突变都表现为APOBEC介导的突变特征（在TpCpX结构中出现高频的C>T或者C>G），而这种突变特征与DNA损伤相关。 2、上皮内瘤变样本与食管鳞癌样本有着相似的变异频谱，包括发生单核苷酸变异、拷贝数变异和结构变异的基因以及变异频率。此外50%以上上皮内瘤变样本与食管鳞癌样本表现出突变的多克隆性以及基因组的多倍性。而单纯增生样本中仅检测出极少数单克隆变异事件，且所有单纯增生样本均为二倍体。 3、整合全基因组、外显子和靶向测序结果发现TP53在上皮内瘤变与食管鳞癌中都是最高频的突变基因，突变频率分别为71.2%和74.3%。通过对有害变异进行通路富集，结果显示TP53，NOTCH，ERBB2-PI3K，DNA修复信号通路，NFE2L2-KEAP1信号通路及SWI/SNF复合体在上皮内瘤变阶段已经存在功能缺陷。 4、对配对样本进行分析，频率在10%以上的主干变异基因功能主要集中于DNA修复与细胞凋亡、细胞增殖以及黏附。结合主干变异的克隆频率分析，结果提示TP53和CDKN2A的突变以及11q(CCND1)，3q(SOX2),2q(NFE2L2)以及9p(CDKN2A)的拷贝数变异是早期癌变驱动事件。 结论： 1、上皮内瘤变与食管鳞癌在基因组变异水平上没有明显的界限，高频的突变以及拷贝数变异说明在上皮内瘤变阶段已经出现了基因组不稳定的特点。 2、DNA损伤是食管鳞癌癌变过程中的一个重要模式。 3、TP53和CDKN2A的突变以及11q，3q，2q，9p的拷贝数变异可能在早期驱动了食管癌变过程。