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背景与目的肝细胞癌（HCC）是我国常见的肿瘤之一,恶性程度极高,易于复发、转移。其死亡率在全部恶性肿瘤中列第二位,仅次于胃癌。肝癌一旦发生,治疗非常困难,预后极差,5年生存率仅2%。因此,积极预防肝癌,研究具有阻断或抑制肝癌发生的药物,不仅具有重要的学术价值,而且可以产生巨大社会经济效益。由于肝癌的发生、发展是一个多阶段的过程,在肝癌形成以前通常会经历一个较长的肝癌前病变过程。因此,如能延缓或阻断肝癌前病变的形成,就有可能阻断肝癌的发生。肝癌前病变在病理学上主要表现为肝细胞非典型增生,而细胞增殖失控和分化障碍是肿瘤的基本特征,所以寻找能抑制肝细胞恶性增殖和诱导其分化的药物,对肝癌的化学预防具有重要的价值。近些年来,中医药在预防肝癌发生方面进行了一些研究探索,并显现出较好的研究前景。已有较多研究发现一些中药具有一定程度的预防肝癌的作用。然而,由于研究周期长、作用因素复杂、对象不易控制等诸多原因,使得中医药在预防肝癌的临床和基础方面的研究较少,能够经得起实验重复和临床验证的中药复方更少。至今未见一种公认有效的肝癌预防制剂应用于临床。正肝方是针对肝癌的中医病机特点组方而成的中药复方,该方主要由黄芪、丹参、鳖甲、女贞子、半枝莲、白花蛇舌草等组成,具有活血软坚、益气养阴、清热解毒的功效。本研究采用组织化学、免疫组化、RT-PCR、PCR-ELISA等方法观察了正肝方对黄曲霉毒素B1（AFB1）诱发的大鼠肝癌前病变的影响,以及正肝方药物血清对人肝癌细胞分化和端粒酶的影响,以明确正肝方对肝癌的预防作用及其主要作用机制。本研究为将正肝方开发为肝癌预防新药,在临床上推广应用,提供一定的理论依据。材料与方法1.动物体内实验Wister雄性大鼠100只,随机分为4组:模型对照组（A组）30只、正肝方小剂量预防组（B组）30只、正肝方大剂量预防组（C组）30只、正常大鼠对照组（D组）10只。除正常大鼠对照组外,先后用AFB1和2-乙酰氨基芴（2-AAF）处理各组大鼠造模。正肝方大、小剂量预防组在造模期间,将正肝方水剂（单味免煎中药粉剂按比例称取,用无菌蒸馏水溶解,配成0.3g/ml和0.6g/ml的水剂）按10ml/kg分别灌喂大鼠;模型对照组（A组）用无菌蒸馏水按10ml/kg灌喂大鼠。8周后处死大鼠,采血,取肝组织标本。将肝组织标本分别HE染色和铀铅染色,光镜、电镜病理观察;采用组织化学法结合电脑图象分析检测肝组织γ-谷氨酰转移酶（GGT）阳性灶、免疫组织化学法（IHC）检测肝组织谷胱甘肽S-转移酶-π（GST-P）阳性灶、增殖细胞核抗原（PCNA）、甲胎蛋白（AFP）、胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-Ⅱ）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）蛋白表达,逆转录PCR（RT-PCR）法检测肝脏组织IGF-Ⅱ、Cyclin D1和CDK4基因表达;比色法检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、GGT、总胆红素（TBIL）、白蛋白（ALB）生化指标。2.体外血清药理实验正肝方水煎剂（1.5g/ml）,灌喂正常大鼠,每日2次,连续3d,于第4d,1次给予全日剂量后1h采血,制备药物血清,药物血清经56℃灭活30min。以正常鼠血清为阴性对照,维甲酸为阳性对照,将药物血清温育Bel-7402人肝癌细胞。噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞增殖,图象分析系统测定细胞核质比,放射免疫法测定细胞分泌的AFP含量,动态比色法测定细胞内GGT和ALP活性,多聚酶链反应—酶联免疫吸附法（PCR-ELISA法）检测细胞端粒酶活性。结果1.动物体内实验1.1各组大鼠一般情况动物实验开始时,各组大鼠体重大小较一致,无统计学差异（P＞0.05）。在整个实验过程中,正常对照组的大鼠体重增长大于造模组（P＜0.01）;模型组（A组）、正肝方小剂量组（B组）和大剂量组（C组）3组间大鼠生长情况相似,体重增长无差异显著性（P＞0.05）。表明正肝方无论是大剂量还是小剂量,对大鼠都是安全的,没有明显的毒副作用。实验结束时,A组死亡12只,B组15只,C组13只,D组无死亡。1.2各组大鼠肝组织形态及细胞超微结构变化光镜下:A、B、C组大鼠的肝组织切片（HE染色）可见到散在的,大小不等的增生肝细胞灶或结节;肝细胞增生灶多少不等,A组最多,C组最少;灶/结节内以嗜碱性肝细胞为主,个别灶内肝细胞浊肿变形、点状坏死;部分灶/结节内肝细胞异型,体积变大,见少量双核、核深染、巨核细胞。电镜下:增生灶内肝细胞可见细胞器排列集中,胞质内含大量线粒体,粗面内质网扩张。细胞核大,不规则,核仁突出,部分细胞双核,可见两个以上核仁,染色质疏松,边集。1.3各组大鼠肝组织GGT和GST-P阳性灶的比较正肝方小剂量组的每个GGT灶面积（mm2/个）少于模型组（P＜0.05）,但单位面积GGT灶个数（个/cm2）、单位面积灶的总面积（mm2/cm2）无明显减少（P＞0.05）。正肝方大剂量组的单位面积GGT灶个数、单位面积灶的总面积和每个灶面积与模型组比均显著减少（P＜0.01）。与小剂量组比,正肝方大剂量组的GGT灶个数、灶的总面积和每个灶面积显著减少（P＜0.01）,提示正肝方减少AFB1诱发的大鼠肝组织GGT灶面积的作用有一定的量效关系。与模型组比,正肝方小剂量组的每个GST-P灶面积（mm2/个）,单位面积GST-P灶个数（个/cm2）、单位面积灶的总面积（mm2/cm2）无明显减少（P＞0.05）。正肝方大剂量组的单位面积GST-P灶个数、单位面积灶的总面积和每个灶面积与模型组比均显著减少（P＜0.05或P＜0.01）,提示大剂量正肝方具有抑制癌前病变肝组织GST-P灶的作用。1.4各组大鼠肝功能的比较与模型组比较,正肝方小剂量组和大剂量组的ALT、GGT、TBIL值显著降低（P＜0.01或P＜0.05）,大剂量组的AST、ALP值也显著低于模型组（P＜0.01或P＜0.05）。与小剂量组比较,大剂量组的ALT值显著低于小剂量组（P＜0.01）,表现出一定的量效关系。以上提示:正肝方能保护肝功能,减轻AFB1和2-AAF导致的肝损伤作用。1.5各组大鼠肝组织PCNA、AFP免疫组化染色结果正肝方大剂量组PCNA和AFP染色的阳性单位（PU）值较模型组均显著降低（P＜0.01或P＜0.05）,大剂量组PCNA和AFP染色的标记指数（LI）值也低于模型组（P＜0.01）。提示大剂量正肝方能有效降低大鼠癌前病变肝组织PCNA和AFP的表达,减轻大鼠癌前病变肝细胞的异常增生。1.6各组大鼠肝组织Cyelin D1、CDK4表达情况正肝方小剂量组和大剂量组Cyclin D1染色的LI和PU值较模型组均显著降低（P＜0.01）,大剂量组Cyclin D1染色的PU值也低于小剂量组（P＜0.05）,呈现出一定的量效关系;正肝方小剂量组和大剂量组CDK4染色的PU值均较模型组显著降低,大剂量组PU值也低于小剂量组。正肝方小剂量组和大剂量组的Cyclin D1和CDK4 mRNA表达水平较模型组表达水平均显著降低（P＜0.01）。提示大剂量正肝方能降低大鼠癌前病变肝组织Cyclin D1、CDK4蛋白和mRNA异常高表达水平。1.7各组大鼠肝组织IGF-Ⅱ表达情况与模型组比较,正肝方小剂量组和大剂量组的PU值显著降低（P＜0.01或P＜0.05）,大剂量组的LI值也低于模型组（P＜0.05）。与模型组比较,对照组IGF-ⅡmRNA相对表达水平最低（P＜0.01）,正肝方小剂量组和大剂量组的IGF-ⅡmRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。与小剂量组比较,大剂量组的IGF-ⅡmRNA表达水平亦显著低于小剂量组（P＜0.01）,呈现出一定的量效关系。提示正肝方能降低大鼠癌前病变肝组织IGF-Ⅱ蛋白和mRNA异常高表达水平。2.体外血清药理实验2.1药物血清对Bel-7402细胞增殖的影响（MTT比色法）对照组、正肝方组、维甲酸组A490值分别为1.704±0.102、1.483±0.077、1.510±0.104。与对照组比,正肝方药物血清组A值显著降低（P＜0.01）。提示正肝方可抑制Bel-7402细胞的增殖。2.2药物血清对Bel-7402细胞核质比的影响对照组、正肝方组、维甲酸组Bel-7402细胞核质比分别为1.04±0.09、0.71±0.07、0.69±0.08。与对照组比,正肝方药物血清组和维甲酸组核质比显著降低（P＜0.01）。提示正肝方可降低Bel-7402细胞核质比。2.3药物血清对Bel-7402细胞分泌AFP的影响对照组、正肝方组、维甲酸组Bel-7402细胞AFP分泌量（ng/106）分别为22.58±2.68、14.60±1.85、13.50±2.50。与对照组比,正肝方药物血清组和维甲酸组AFP分泌量显著低于对照组（P＜0.01）,表明正肝方和维甲酸均可抑制Bel-7402细胞分泌AFP。2.4药物血清对Bel-7402细胞GGT和ALP活性的影响与对照组比,正肝方药物血清组和维甲酸组细胞内GGT活性明显降低（P＜0.05）,ALP活性显著增高（P＜0.01）。提示正肝方可降低Bel-7402细胞内GGT活性,升高ALP活性。2.5药物血清对Bd-7402细胞端粒酶活性的影响Bel-7402对照组、正肝方组A450值分别为0.929±0.066、0.360±0.105。两者比较,正肝方药物血清组端粒酶活性显著低于Bel-7402细胞对照组（P＜0.01）,即正肝方可抑制Bel-7402细胞的端粒酶活性。结论正肝方具有预防化学致癌物引起的肝癌前病变作用,其机理可能是通过影响IGF-Ⅱ癌基因及蛋白的异常表达,经内源性调控和（或）外源性调控作用于细胞增殖周期,抑制肝细胞增殖活性,阻断肝细胞异常增生,起到延缓或阻断肝癌前病变发生、发展的作用。此外,正肝方具有诱导Bel-7402人肝癌细胞分化的作用,其机理可能是抑制了Bel-7402细胞端粒酶活性。