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目的:血管钙化可发生在老年,动脉粥样硬化以及代谢性疾病中,例如糖尿病和终末期肾病。TGF-β1能够促进血管平滑肌细胞(VSMCs)的分化和调节细胞钙化。3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A抑制剂(他汀类药物)在心血管疾病中发挥出多方面的益处。β-catenin转移至核内参与血管钙化过程促进特定基因的表达。自噬作为高度保守的细胞活动通过溶酶体依赖途径调节胞质内蛋白更新。然而,目前关于他汀类药物通过自噬和β-catenin信号通路对平滑肌细胞成骨样分化的影响研究尚少。有关血管钙化的调节机制已有很多理论观点,但是自噬活动在调控平滑肌细胞成骨样分化中的作用和分子机制研究尚少。有学者认为作为细胞自我保护机制的自噬活动可直接促进胶原的降解,而胶原也是细胞成骨样分化中的标志蛋白之一。因此本研究旨在研究阿托伐他汀通过诱导自噬和影响TGFβ1/β-catenin信号通路进而发挥抑制成骨样分化的相关作用机制。方法:本研究从细胞分子水平,考察TGFβ1对VSMCs中β-catenin表达和功能的影响以及对成骨样分化标志性蛋白表达的影响;利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR、小干扰RNA转染以及激光共聚焦技术探讨自噬及β-catenin转录蛋白在TGFβ1通路诱导成骨样分化中的作用及信号调节机制。而且利用相关信号通路抑制剂,自噬抑制剂进一步证实了阿托伐他汀在抑制TGF-β1诱导的成骨样分化中的作用机制。旨在为阿托伐他汀在血管退行性疾病中的应用提供新的理论依据,为退行性血管病的防治提供新的靶点。结果:1阿托伐他汀抑制TGF-β1诱导的平滑肌细胞的成骨样分化结果显示TGF-β1刺激细胞6、12、24、48、72小时,Western blot结果证实TGF-β1可促进成骨样分化标志蛋白如Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen),骨形成蛋白(BMP-2)和骨钙素(osteocalcin)的蛋白水平表达增加并呈时间依赖性。然而,应用阿托伐他汀预处理平滑肌细胞24小时后,与单独TGF-β1刺激组比较,钙盐沉积明显减少,同样观察到在蛋白水平阿托伐他汀可使上述成骨样分化标志蛋白表达明显下降。2阿托伐他汀通过诱导自噬抑制平滑肌细胞成骨样分化2.1在电镜下观察平滑肌细胞,结果显示自噬泡在正常细胞中较少见。在TGF-β1诱导的平滑肌成骨样分化的过程中有少量的自噬泡形成。而当采用阿托伐他汀预处理平滑肌细胞24小时继而应用相同浓度TGF-β1,电镜结果显示细胞质中出现大量的自噬泡。应用吖啶橙染色观察自噬泡可以得到相同的结论。2.2Western blot结果显示,阿托伐他汀可使自噬相关蛋白Beclin-1和Atg5的表达增加并呈时间依赖性。LC3Ⅱ:LC3Ⅰ同样也在阿托伐他汀预处理后较TGF-β1组明显升高。2.3为了进一步明确自噬与成骨样分化的关系,利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)在自噬过程中可抑制自噬泡(AVs)的形成。研究应用3-MA后发现其可明显抑制阿托伐他汀诱导的LC3Ⅱ:LC3Ⅰ增高,同时阿托伐他汀发挥出的抑制成骨样分化的作用也在应用3-MA后被减弱。3阿托伐他汀通过下调β-catenin表达诱导平滑肌细胞自噬3.1观察β-catenin在阿托伐他汀抑制TGF-β1诱导的平滑肌细胞成骨样分化中的作用。研究中观察到TGF-β1不仅可以使其经典的pSmad2/3发生核转位,而且可使β-catenin同样发生核转位。Western blot结果显示:TGF-β1可使β-catenin呈时间依赖性的增高。3.2研究TGF-βRI及β-catenin在自噬和钙化的作用,应用TGF-βRI激酶抑制剂SD208或者β-catenin抑制剂JW74均明显加重TGF-β1诱导自噬,但上述二者可减少TGF-β1诱导的平滑肌细胞成骨样分化。以上结果说明TGF-βRI与β-catenin参与TGF-β1诱导的自噬和钙化。3.3为了进一步明确阿托伐他汀诱导的自噬是否依赖于下调β-catenin水平,采用阿托伐他汀预处理细胞,western blot结果显示,阿托伐他汀可明显降低TGF-β1诱导的β-catenin蛋白水平表达。为进一步明确阿托伐他汀在TGF-β1诱导的自噬和钙化中的作用。利用重组蛋白Wnt3A过表达β-catenin进而增加功能性β-catenin水平。研究表明,Wnt3A明显增加β-catenin表达,同时阿托伐他汀诱导的自噬可以被Wnt3A明显抑制。而阿托伐他汀对TGF-β1诱导钙化的抑制作用同样可被Wnt3A抵消。这些数据均表明β-catenin在阿托伐他汀诱导自噬和抑制钙化过程中发挥着关键作用。结论:1阿托伐他汀抑制TGF-β1诱导的平滑肌细胞的成骨样分化。2阿托伐他汀通过诱导自噬抑制平滑肌细胞成骨样分化。3阿托伐他汀通过下调β-catenin表达诱导平滑肌细胞自噬进而发挥抑制成骨样分化作用。